代 培，許光遠(yuǎn)，劉銅華，高 明，蘇 通，周靜鑫，喬 羽，郭翔宇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院，北京 100038；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；4．日本武庫(kù)川女子大學(xué)藥學(xué)部，日本 兵庫(kù) 6638179；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院通州院區(qū)，北京 101121)

隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率逐年升高[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為超重和肥胖是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。中醫(yī)學(xué)對(duì)肥胖導(dǎo)致糖尿病的觀點(diǎn)早在《素問(wèn)·奇病論》中就有明確提出：“脾癉為肥美之人所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”?！爸沃蕴m，除陳氣也”是糖尿病治療的原則。番石榴葉(Guava leaf)具有燥濕健脾、清熱解毒的功效，是中醫(yī)用來(lái)治療糖尿病的常用藥材。本研究中，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠成肌細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、Ⅲ型纖連蛋白域包含蛋白5(Type Ⅲ fibronectin domain contains protein 5，F(xiàn)NDC5)以及脂肪組織SVF細(xì)胞PR結(jié)構(gòu)域16(PR domain-containing 16，Prdm16)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示番石榴葉提取物調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究動(dòng)物：購(gòu)買6周齡雄性SPF級(jí)db/db(品系為C57BLKS)小鼠24只、同齡C57BL/6J正常組小鼠6只，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑：血糖儀(Bayer公司)，DMEM培養(yǎng)基(Lot:31331093，Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Lot：10100147，Gibco-BRL公司)，胰蛋白酶(Lot：T2600000，Sigma公司)，膠原酶(Lot：C6079，Sigma公司)，F(xiàn)icoll400(Lot:20190530，Pharmacia公司)，結(jié)蛋白單克隆Desmin抗體(批號(hào) ZA-0610，中杉生物公司)，MTT Assay試劑盒(Lot：211091，Amerison公司)，CD31單克隆抗體(Lot：77699S，CST公司)，CD34單克隆抗體(Lot：3569，CST公司)，Anti-PGC-1α抗體(Lot：ab191838，Abcam公司)，重組Anti-FNDC5抗體(Lot：ab174833，Abcam公司)，Anti-Prdm16抗體(Lot：ab106410，Abcam公司)，Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Lot：7074，CST公司)，猴抗山羊FITC二抗(Lot：F4891，Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物制備：番石榴葉提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備。提取工藝具體操作如下：番石榴葉片粉碎后取粗粉1.1 kg，用3倍量乙酸乙酯在25 ℃、超聲50 MHz條件下提取10 min，重復(fù)共7次，過(guò)濾取藥渣，用5倍量的乙醇超聲提取15 min，重復(fù)4次，留取過(guò)濾液， 濃縮得浸膏。浸膏與4倍量水制成混懸液，6000 r/min條件下離心15 min得上清液1；乙醇提取剩余藥渣用5倍量水超聲提取40 min，重復(fù)2次，將2次過(guò)濾所得濾液合并，在6000 r/min的條件下離心15 min得上清液2，合并上清液1、2，采用改良明膠法去除鞣質(zhì)，再次過(guò)濾后濾液上聚酰胺 (100～200目) 柱，依次用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，制得水浸膏64.07 g。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥：適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，禁食12 h，斷尾后用血糖儀檢測(cè)空腹血糖。將空腹血糖≥7.0 mmol/L的db/db小鼠納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為模型組和番石榴葉提取物高劑量組、番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組，四組各6只，同齡C57BL/6J小鼠6只為正常組。用體表面積法計(jì)算每日小鼠給藥量，番石榴葉提取物按高(14 mg/kg)、番石榴葉提取物中劑量(7 mg/kg)、番石榴葉提取物低劑量(3.5 mg/kg)，每日灌胃1次，正常組和模型組灌予等體積蒸餾水，連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠均以普通飼料喂養(yǎng)，且除實(shí)驗(yàn)要求空腹禁食外，均自由進(jìn)食、飲水。

1.2.3 觀察指標(biāo)：觀察小鼠一般情況、每2周檢測(cè)空腹血糖及體重，處死、取材及檢測(cè)生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)?zāi)┘吹?9天空腹脫臼處死所有小鼠，眼眶取血，檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯(Triglycerides，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)：①原代成肌細(xì)胞培養(yǎng)及純化：空腹脫臼處死db/db小鼠、C57BL/6J小鼠后，取后腿腓腸肌組織剪碎，0.125%胰酶消化分離細(xì)胞，離心后用配置好的培養(yǎng)基(含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基)制備細(xì)胞懸液，并按2×105個(gè)/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將制備好的Ficoll400梯度液用D-Hanks液配制成200 g/L，進(jìn)行稀釋配制成梯度離心液。取原代培養(yǎng)第2天的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。②原代脂肪組織SVF細(xì)胞培養(yǎng)、接種和傳代：空腹脫臼處死db/db小鼠和C57BL/6J小鼠后，取皮下脂肪組織剪碎，用1%BSA和0.1% N型膠原酶消化分離細(xì)胞，間斷振蕩后終止消化，離心后重懸計(jì)數(shù)，移入含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)鏡下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)約70%～80%時(shí)即會(huì)傳代。

1.2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成肌細(xì)胞、第3代脂肪組織SVF細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml密度接種至96孔板。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，具體分組情況如下：正常對(duì)照組、模型組、番石榴葉提取物高劑量組、番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組(終濃度分別為10、50、100 μg/ml)。

1.2.6 蛋白水平檢測(cè)：各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并提取蛋白。Western blot法檢測(cè)各組成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)；并檢測(cè)各組脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重及空腹血糖比較 第4周時(shí)，和正常組相比，模型組小鼠體重、空腹血糖均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，番石榴葉提取物高劑量組小鼠體重及血糖均低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠血脂情況比較 和正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG和LDL含量明顯升高，HDL含量明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，番石榴葉提取物各劑量組小鼠TC含量無(wú)明顯改善，TG含量降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組HDL明顯升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；番石榴葉提取物高劑量組LDL水平降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠體重及空腹血糖比較

表2 各組小鼠血脂情況比較(mmol/L)

2.3 各組成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5蛋白以及脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)比較 與正常組小鼠成肌細(xì)胞比較，模型組小鼠成肌細(xì)胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)均低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組小鼠成肌細(xì)胞比較，番石榴葉提取物高劑量組小鼠成肌細(xì)胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織的SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)均高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3(圖1、2)。

表3 各組成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)比較

NC：正常組；DM：模型組；FSL-H：番石榴葉提取

NC：正常組；DM：模型組；FSL-H：番石榴葉提取

3 討 論

超重和肥胖是2型糖尿病的主要危險(xiǎn)因素之一[2]。肥胖多由于脂肪組織分布不均導(dǎo)致，哺乳動(dòng)物的脂肪組織主要有白色脂肪組織(White adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(Brown adipose tissue，BAT)，WAT具有機(jī)械保護(hù)、隔熱和儲(chǔ)能的作用，BAT主要調(diào)節(jié)產(chǎn)熱[3-5]，肥胖的特征在于WAT質(zhì)量的增加[6-7]。PGC-1α、FNDC5、Irisin等代謝因子，能促進(jìn)線粒體生成、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、增加能量代謝，從而減少代謝性疾病的發(fā)病率[8]。PGC-1α主要存在于線粒體含量豐富的組織，如骨骼肌、BAT，在WAT棕色化中發(fā)揮了重要作用[9-10]。Prdm16是BAT特異性輔助因子，與WAT細(xì)胞相比，該輔助因子在BAT細(xì)胞中高度表達(dá)，對(duì)于BAT細(xì)胞的形成至關(guān)重要[11]，同時(shí)，Prdm16也促進(jìn)了WAT棕色化[12]，Prdm16通過(guò)與C末端結(jié)合蛋白相互作用來(lái)抑制經(jīng)典的WAT細(xì)胞基因，并刺激WAT中參與產(chǎn)熱作用的PGC-1α、解偶聯(lián)蛋白1(Uncouple protein 1，UCP1)的轉(zhuǎn)錄[13-14]。

番石榴葉具有燥濕健脾、清熱解毒的功效。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，番石榴葉提取物具有降低血糖、體重、血脂等作用[15-17]。在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證實(shí)了番石榴葉提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌的AMPK-PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)白色脂肪組織棕色化減輕體重[18]。本研究中，我們觀察了番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5，以及脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，番石榴葉提取物高劑量組能明顯降低糖尿病小鼠的體重、血糖、LDL水平，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，番石榴葉提取物能顯著提高小鼠成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5以及脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白表達(dá)。番石榴葉提取物分別上調(diào)成肌細(xì)胞PGC-1α、FNDC5和脂肪組織SVF細(xì)胞Prdm16蛋白水平，說(shuō)明番石榴葉提取物可以通過(guò)促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化，提高棕色脂肪水平，從而通過(guò)增加機(jī)體的能量代謝來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

番石榴葉提取物促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充實(shí)了“治之以蘭，除陳氣也”的理論基礎(chǔ)，為臨床匯總燥濕健脾類中藥降低血糖、體重提供了新思路。