羅韋，李輝*，陳林，葉濤，黃錫陽，司宗貴

(1. 貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4. 貴州竹香雞養(yǎng)殖有限公司，貴州 赤水 564708)

赤水烏骨雞是貴州省赤水市的地方家禽品種[1]。赤水烏骨雞產(chǎn)綠殼蛋，蛋具有低膽固醇、低脂肪的特性，富含硒、鐵、鋅等多種微量元素[2]。早期遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋綠殼性狀是單基因(O基因)控制的常染色體顯性遺傳性狀[3]，在選育過程中雜合體也表現(xiàn)為綠殼性狀，所以采用表型選擇方法選育周期較長[4]。王哲鵬等[5]研究發(fā)現(xiàn)雞3號染色體上EAV-HP的長末端重復(fù)序列反向插入到雞的1號染色體SLCO1B3基因的啟動子區(qū)，促使SLCO1B3基因過量表達(dá)，導(dǎo)致蛋殼呈現(xiàn)綠色。目前，已確定SLCO1B3基因為蛋殼呈現(xiàn)綠色的主效基因，但是實際生產(chǎn)中，盡管純合子的綠殼蛋雞都產(chǎn)綠殼蛋，但蛋殼的綠色程度卻深淺不一[6]，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能與其他影響蛋殼綠色的微效基因有關(guān)。本課題組陳林[7]對300日齡赤水烏骨雞的蛋殼腺進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出絲氨酸蛋白酶抑制劑1基因(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin),member 1,SPIA1)為蛋殼綠色深淺的上調(diào)基因。

SPIA1基因最早是在原雞身上發(fā)現(xiàn)的，目前關(guān)于SPIA1基因的研究未見報道。本研究為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，以SLCO1B3基因作為分型基因，對赤水烏骨雞母雞進(jìn)行基因分型，進(jìn)而根據(jù)基因型及蛋殼顏色的深淺對赤水烏骨雞進(jìn)行分類，然后檢測不同產(chǎn)蛋期不同蛋殼綠色深淺的赤水烏骨雞母雞蛋殼腺和肝臟中SPIA1基因的表達(dá)量，以期發(fā)現(xiàn)SPIA1基因的表達(dá)量與蛋殼綠色深淺之間的關(guān)系，同時鑒定與綠殼蛋顏色變異相關(guān)的基因，為綠殼蛋的遺傳機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

赤水烏骨雞由貴陽市綠源有限公司種雞場提供，隨機(jī)挑選出180、360、540日齡的品種特征明顯、長勢相近、健康無病的赤水烏骨雞母雞。

根據(jù)SLCO1B3基因設(shè)計引物，利用雙重PCR對赤水烏骨雞進(jìn)行基因分型，選留綠殼純合型和綠殼雜合型，觀察每只雞每天的產(chǎn)蛋時間及蛋殼顏色連續(xù)2周，按照基因型和蛋殼綠色的深淺分為6類：純合子深綠色、純合子淺綠色、純合子淡綠色、雜合子深綠色、雜合子淺綠色、雜合子淡綠色。每種類型選擇產(chǎn)蛋顏色重復(fù)性較好，產(chǎn)蛋時間比較規(guī)律的雞各3只，在產(chǎn)蛋前2.5～3 h屠宰，屠宰后采集肝臟和蛋殼腺各20 g，用生理鹽水沖洗并用錫箔紙包裹后迅速放入液氮罐內(nèi)，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

在GenBank中檢索到雞SPIA1基因和SLCO1B3基因mRNA的序列(兩個基因的登錄號分別為NM_001277493.1和NM_001318449.1)，運(yùn)用Primer Primer5設(shè)計引物，引物由貴陽春滿谷生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

SLCO1B3基因的PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix(購自天根生化科技(北京)有限公司)10 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，退火溫度51.3 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察基因型。

SPIA1基因的PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix 10 μL購自天根生化科技(北京)有限公司，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，退火溫度52.1 ℃，退火時間35 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 蛋殼原卟啉和膽綠素的測定

測定方法參考劉敬壽等[8]和卜小雁[9]的方法。稱取原卟啉0.36 mg，膽綠素0.26 mg，溶解于6 mL溶劑中，溶劑由濃鹽酸和甲醇按1∶2的比例配制而成，漩渦振蕩，避光保存12 h，分別制成原卟啉和膽綠素的標(biāo)準(zhǔn)原液[8]。將原液稀釋成2、4、8、16、32、64、128、256倍，利用紫外分光光度計分別測定在412和680 nm處蛋殼溶解液的吸光值[8-9]。

1.2.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

本試驗采用Trizol法提取總RNA，并將總RNA濃度稀釋至1 000 ng/μL，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR

對不同產(chǎn)蛋期的赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量，本試驗運(yùn)用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。采用20 μL體系：SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運(yùn)用EXCEL和SPSS 18.0軟件對本試驗的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01，結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLCO1B3基因的PCR擴(kuò)增

結(jié)果如圖1所示：純合子綠殼(SL/SL)產(chǎn)物片段大小為884 bp、雜合子綠殼(SL/W)為884和732 bp、純合子非綠殼(W/W)為732 bp，與目標(biāo)片段大小一致。

2.2 蛋殼膽綠素含量分析

表2顯示，在對180日齡不同基因型的不同綠色蛋殼進(jìn)行膽綠素含量測定和分析時發(fā)現(xiàn)：同一基因型中蛋殼綠色越深其膽綠素含量越高，且達(dá)到了極顯著差異的水平(P<0.01)；蛋殼顏色相同時，雜合子和純合子間蛋殼膽綠素含量不存在顯著差異(P>0.05)。

1、2. 非綠殼純合子；3、4. 綠殼雜合子；5、6. 綠殼純合子；7. DL 2000 DNA Marker

表2 180日齡不同綠色蛋殼的膽綠素含量 mol/L

2.3 SPIA1基因的差異表達(dá)與蛋殼顏色深淺的關(guān)系分析

2.3.1 赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)情況

表3結(jié)果顯示，基因型相同時，蛋殼顏色越深，則SPIA1基因在其蛋殼腺中的表達(dá)量就越高。具體表現(xiàn)為深綠色極顯著高于淺綠色和淡綠色(P<0.01)，淺綠色與淡綠色間不存在顯著差異(P>0.05)，但是淺綠色中的表達(dá)量高于淡綠色中的表達(dá)量。

表3 SPIA1基因在蛋殼腺中不同顏色間的差異表達(dá)

蛋殼顏色相同時，SPIA1基因在不同基因型的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)情況為：在360日齡，蛋殼顏色為深綠色時，SPIA1基因在純合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)量極顯著高于雜合子(P<0.01)；在540日齡，蛋殼顏色為深綠色時，SPIA1基因在純合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)量顯著高于雜合子(P<0.05)。其余情況下，SPIA1基因在純合子和雜合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)量不存在顯著差異(P>0.05)。

圖2結(jié)果顯示，純合型深綠色或雜合型深綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量均極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淺綠色或雜合型淺綠色的條件下，180日齡和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量均顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淡綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；雜合型淡綠色的條件下，不同日齡間不存在顯著差異(P>0.05)，但180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量均高于360日齡。

注：若達(dá)到極顯著水平，則兩圖柱標(biāo)注不同大寫字母(P<0.01)；若達(dá)到顯著水平，則標(biāo)注不同小寫字母(P<0.05)；若不存在顯著關(guān)系，則不標(biāo)注字母(P>0.05)。下同

2.3.2 赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達(dá)情況

表4結(jié)果顯示同一基因型的赤水烏骨雞中，產(chǎn)蛋的蛋殼綠色越深，SPIA1基因在其肝臟中的表達(dá)量就越高。具體表現(xiàn)為深綠色極顯著高于淺綠色和淡綠色(P<0.01)，淺綠色高于淡綠色，但是沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)；360日齡時，雜合子的赤水烏骨雞中SPIA1基因在肝臟中的表達(dá)量表現(xiàn)為深綠色顯著高于淺綠色(P<0.05)，深綠色與淡綠色間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 SPIA1基因在肝臟中不同蛋殼顏色間的差異表達(dá)

蛋殼顏色相同時，360日齡，深綠色蛋殼的條件下，SPIA1基因在純合子的赤水烏骨雞肝臟中的表達(dá)量顯著高于在雜合子中的表達(dá)量(P<0.05)；其他情況下都表現(xiàn)為蛋殼顏色相同時，SPIA1基因在純合子和雜合子赤水烏骨雞肝臟中的表達(dá)量不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3結(jié)果顯示，純合型深綠色或雜合型深綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達(dá)量均極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淺綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達(dá)量顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；雜合型淺綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達(dá)量極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淡綠色或雜合型淡綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達(dá)量均顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同日齡赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的差異表達(dá)

3 討論

蛋殼膽綠素是在肝臟中合成并由殼腺部分泌的[9]。相關(guān)研究顯示，蛋殼顏色是可遺傳性狀，且遺傳力較高，蛋殼顏色的遺傳力為0.58～0.76[10-11]。蛋殼顏色是由沉積于蛋殼中的色素引起的，原卟啉和膽綠素是兩種主要的蛋殼色素[12]，綠殼蛋的綠色主要是由膽綠素的沉積引起的[13-14]。因此，本試驗收集180日齡的蛋殼測其膽綠素含量，并分析了膽綠素含量與蛋殼顏色之間的關(guān)系，結(jié)果顯示蛋殼綠色越深其膽綠素含量越高，對SPIA1基因的表達(dá)量與蛋殼中膽綠素的含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)呈極顯著正相關(guān)，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果SPIA1基因為蛋殼綠色的上調(diào)基因一致。

不同產(chǎn)蛋期的赤水烏骨雞蛋殼腺和肝臟中SPIA1基因的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，無論是純合子還是雜合子的赤水烏骨雞，不同產(chǎn)蛋期SPIA1基因的表達(dá)量均存在差異。其中360日齡時的表達(dá)量顯著低于180和540日齡，180與540日齡間差異不顯著，造成這一現(xiàn)象的原因有待于進(jìn)一步研究。白激榮[15]的研究顯示，由于綠殼蛋的色素是在肝臟中合成的，如果合成速度較低，產(chǎn)蛋率提高就會使得單個個體綠色變淺，這與本研究數(shù)據(jù)顯示的結(jié)果一致。同時，相關(guān)研究顯示，EVP-HP插入會使得綠殼主效基因SLCO1B3基因在綠殼蛋雞蛋殼腺中高表達(dá)，同時減弱了其在肝臟中的表達(dá)[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達(dá)量明顯高于肝臟組織，這與綠殼主效基因SLCO1B3基因的表達(dá)特點相似?；谝陨辖Y(jié)果，推測SPIA1基因可能是影響蛋殼綠色的微效基因。關(guān)于SPIA1基因的遺傳機(jī)制尚不清楚，后續(xù)需對該基因進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

SPIA1基因在赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達(dá)量均表現(xiàn)為純合子高于雜合子，在不同基因型都表現(xiàn)為隨蛋殼綠色加深SPIA1基因的表達(dá)量增高，與本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果顯示SPIA1基因為蛋殼顏色的正調(diào)控基因相符合，并且與本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示的SPIA1基因的表達(dá)量與蛋殼膽綠素含量呈極顯著正相關(guān)一致，推測該基因可能為綠殼蛋顏色的正調(diào)控基因，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。