張 凡，李書田，王顯瑞，沈 群*

（1 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室國家果蔬加工工程技術研究中心 北京100083 2 赤峰市農牧科學研究院谷子研究所 內蒙古赤峰024031）

小米（foxtail millet），屬禾本科、狗尾草屬的一年生草本植物，原產(chǎn)于我國北方黃河流域，其種植歷史可追溯到8 000年前。小米營養(yǎng)豐富，各種營養(yǎng)素比例適宜，富含膳食纖維、礦物質（鈣和鐵）、維生素B 和多酚類物質等。此外，小米粗蛋白屬低過敏性蛋白，可供麩質過敏人群食用，且小米多肽被證實具有抗氧化、降血壓、修復肝損傷以及參與機體免疫調節(jié)等功能活性[1-3]。小米蛋白質含有人體必需的8 種氨基酸，且含量遠高于大米、玉米、小麥等谷物[4]。小米蛋白質是一種良好的植物來源蛋白，可以綜合開發(fā)利用，以緩解蛋白質資源短缺問題。

長期以來，高質量小米蛋白質的提取是一個難以解決的問題，表現(xiàn)為提取率不高，蛋白質含量低[5-6]。小米胚乳中淀粉顆粒和蛋白體的緊密結合，蛋白質分子內及分子間的二硫鍵，高疏水性蛋白組分（醇溶蛋白）以及單寧等物質的存在，均阻礙了小米分離蛋白的提取[7-8]。常見的小米蛋白提取方法有鹽法、堿法和酶法，前兩種方法提取率低，資源消耗大且污染環(huán)境，劇烈的提取條件還可能導致蛋白中生物活性物質的降解[9-10]。酶法又可分為碳水化合物類酶和蛋白酶兩種，前者通過水解細胞壁、纖維素、淀粉等非蛋白組分，使蛋白質與之分離，后者直接對小米蛋白進行降解及修飾，使之成為可溶的多肽而被提取出來[11]。目前大多數(shù)研究集中在如何提高蛋白提取率，忽視了小米分離蛋白（MPI）中蛋白質的含量及組成。通過分析不同酶法條件下MPI 的提取率、蛋白質含量、分子質量分布及二級結構，篩選適合的工藝并結合響應面法進一步優(yōu)化，旨在獲得組成全面、結構信息完整且蛋白質含量高的MPI，為其今后的深入研究、開發(fā)與利用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米品種為毛毛谷（粗蛋白含量9.24%），赤峰市農牧科學研究院提供。根據(jù)小米的化學組成及細胞壁結構，選用5 種酶對其水解，分別是：α-淀粉酶（50 U/mg）、糖化酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）及普魯蘭酶（≥1 U/mg），均購于上海源葉有限公司；復合纖維素酶（葡聚糖酶活力700 EGU/g，木聚糖酶活力250 FXU/g），丹麥諾維信有限公司。其它試劑為分析純級。

1.2 儀器與設備

半自動凱氏定氮儀KN520，濟南阿爾瓦儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，美國PkinElmer 公司；電泳槽及電泳儀，美國Bio-Rad公司；GE Healthcare 凝膠成像儀，美國通用電氣醫(yī)療公司；水浴恒溫振蕩器，上海龍躍有限公司；冷凍干燥機FD-1A-50，北京博醫(yī)康有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 篩選酶解方法

1.3.1.1 酶法提取小米分離蛋白 用蒸餾水將小米淘洗3 次，低溫烘干，粉碎機碾磨成粉，過60 目篩，室溫下按料液比1∶5 添加正己烷脫脂4 h 得小米脫脂粉，備用。按照表1 方法酶解小米脫脂粉。試驗中酶解溫度及溶液pH 值始終在最適酶活范圍內。雙酶或三酶等量添加。酶解后5 000 min 離心20 min，除2 號試驗組離心、取上清外，其余組離心、沉淀，水洗數(shù)次至中性，復溶，凍干48 h，備用。

表1 不同提取方法下的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions by different extraction methods

將堿法提取MPI 作為酶解法的對照。準確稱取定量脫脂小米粉，按料液比1∶7 加蒸餾水，加拌均勻后用0.1 mol/L NaOH 調至pH 9.5，溫度控制為30 ℃，水浴震蕩1.5 h，5 000 r/min 離心20 min，取上清，調節(jié)pH 4.0，靜置0.5 h，5 000 r/min 離心20 min，水洗數(shù)次沉淀至中性，復溶，凍干48 h，備用。

1.3.1.2 蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法，參照GB5009.5-2016 方法對堿法及酶法提取物進行蛋白含量測定[12]。小米蛋白氮轉化系數(shù)為5.83。由公式（1）、（2）分別計算提取率和純化因子。

式中，A——凍干粉的質量（g）；C——凍干粉的蛋白質含量（%）；B——稱取的脫脂小米粉質量（g）；D——脫脂小米粉中蛋白質含量（%）。

1.3.1.3 蛋白質分子質量分布測定 參考徐婧婷等[13]的方法對MPI 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。主要步驟是：確定凝膠濃度→制備電泳膠→處理蛋白樣品→上樣→恒壓下電泳→染色→脫色。使用Quantity One v4.62 對將脫色后的電泳凝膠進行分子質量分析。

1.3.1.4 蛋白質二級結構測定[14]室溫條件下使用傅里葉紅外光譜儀（FTIR）在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍對MPI 掃描。以光譜純的溴化鉀壓片作為空白。按照1∶200 的比例加入蛋白樣品和溴化鉀，研磨均勻后壓片。掃描條件：分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)256。使用PeakFit v4 軟件在酰胺Ⅰ帶范圍對蛋白質二級結構進行分析。

1.3.2 酶法提取小米分離蛋白工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素條件探究 根據(jù)上述試驗結果，為進一步得到高蛋白含量的MPI，選擇最優(yōu)酶解方法進行優(yōu)化。在單因素試驗中考察料液比、小米脫脂粉粉碎目數(shù)、pH 值、酶解溫度、加酶量和酶解時間對蛋白質含量的影響，各水平設置條件見表2。

1.3.2.2 酶法工藝優(yōu)化 以酶解后所得蛋白質含量為考察值，根據(jù)單因素試驗結果，選取pH 值、溫度、加酶量及酶解時間為試驗因素。通過Box-Behnken 的中心組合試驗設計（表3）進行四因素三水平分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 所有試驗均重復3 次，使用IBM 公司的SPSS Statistics 25 軟件進行方差分析及Duncan 分析，采用Origin Pro 2015 軟件繪圖，Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計。

表2 酶法提取小米分離蛋白響應面分析因素和水平Table 2 Factors and levels for response surface analysis of enzymatic extraction of foxtail millet isolate protein

表3 Box-Behnken 試驗因素水平編碼表Table 3 The factors and levels of Box-Behnken design

2 結果與討論

2.1 不同酶解方法的比較與篩選

2.1.1 小米分離蛋白含量 圖1 顯示不同提取方法下MPI 的提取率、蛋白含量及純化因子。純化因子代表在該方法下MPI 被提出的程度，從側面反映MPI 中的蛋白質含量。在提取率一定的前提下，為得到蛋白質含量較高的MPI，重點研究蛋白含量。從圖1 可看出，雖然堿溶酸沉條件下MPI 的蛋白質含量最高（65.91%），但是此時MPI 的提取率遠低于其余5 種酶法，僅5.17%。劉劍利等[5]優(yōu)化堿法提取MPI 的工藝條件后，提取率達38.79%。楊樺[11]對超聲波輔助酶法提取MPI 的工藝進行優(yōu)化，提取率達（74.26±1.2）%。由此可見堿法條件下MPI 的提取率遠不如酶法。許多研究認為強堿條件下提取蛋白可能伴隨著蛋白質的變性、水解，形成有毒物質賴丙氨酸，美拉德反應加重引起蛋白產(chǎn)物顏色過深等不良反應[15]。相比之下，酶法條更為溫和，反應針對性強。

圖1 酶解條件對MPI 提取率、蛋白質含量及純化因子的影響Fig.1 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on extraction yield，protein content and purification factors of MPI

堿性蛋白酶法所得MPI 蛋白質含量較高，為41.8%。然而，堿性蛋白酶條件下會導致所提蛋白質部分水解以及結構、理化性質改變，因而不予采納[16-17]。就MPI 蛋白質含量以及提取率而言，三酶法＞雙酶法＞單酶法。提取率均能達到47%以上，其中α-淀粉酶/糖化酶/普魯蘭酶法提取率最高，為80.98%；α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶法的MPI蛋白質含量最高，達44.07%，此時蛋白純化因子為4.77。

淀粉是小米的主要成分，碳水化合物類酶的加入可將除蛋白外的諸如淀粉等大分子物質水解[18]。將鑲嵌在蛋白質基質中的淀粉粒以及與蛋白體緊密結合的淀粉顆粒分離開來，所得MPI 的蛋白質含量高[19]。α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶在酶解過程中，復合纖維素酶可破壞細胞壁成分，有利于淀粉酶的進入以及蛋白體的釋放，α-淀粉酶作用于淀粉鏈上的α-1，4-糖苷鍵，水解產(chǎn)生糊精、低聚糖，糖化酶則從非還原末端切開α-1，4-糖苷鍵并緩慢切開α-1，6-糖苷鍵，使淀粉最終水解成小分子的葡萄糖。此時淀粉被水解，胚乳細胞中的蛋白被分離，獲得蛋白含量最高的MPI。而在提取方法4（α-淀粉酶/糖化酶/普魯蘭酶）中，普魯蘭酶作為脫支酶的一種，可專一性水解麥芽三糖和以α-1，6 糖苷鍵連接起來的聚合物，與α-淀粉酶/糖化酶聯(lián)合使用可徹底水解淀粉。然而，淀粉顆粒、蛋白體等物質均存在于胚乳細胞中，細胞壁的存在可能限制了酶與淀粉底物的接觸，因而相同條件下，復合纖維素酶破除細胞壁屏障，釋放內含物與酶發(fā)生接觸，從而使淀粉水解更為徹底[20-21]。

2.1.2 小米分離蛋白分子質量分布 不同提取條件下MPI 分子質量分布見圖2 及表4。提取方法不同，MPI 分子質量分布情況不同。整體而言，MPI中小分子質量的蛋白質居多。小米清、球蛋白譜帶分布廣泛，主要集中在高分子質量范圍，其中70，56，35，20 ku 被認為是球蛋白的特征譜帶[13，22]，這些條帶在圖2 中均明顯存在。文獻[21]稱不同酶解方法如高溫淀粉酶解、高溫淀粉酶/復合纖維素酶解（Multifect XL）對大米可溶性蛋白的組分沒有影響。醇溶蛋白約占小米總蛋白的60%，主要包含27～13 ku 亞基，根據(jù)其溶解性不同還可細分為α醇溶蛋白（18～21 ku）、β 醇溶蛋白（15 ku）以及γ醇溶蛋白（23 ku）[23-24]。此外，谷蛋白作為小米另一貯藏蛋白，蛋白譜帶雖分布廣泛，但也主要集中在低分子質量范圍。MPI 電泳圖中相當一部分條帶集中在小分子質量范圍。

相比于淀粉酶類法，堿性蛋白酶法（泳道2）及堿溶酸沉法（泳道6）得到的小米總蛋白分子質量分布相似，小于30 ku 的蛋白條帶分布均低于55%，可能是由于在強堿性條件下提取的蛋白主要為谷蛋白，而此時疏水性較強的醇溶蛋白未能被完全提取。有報道稱，堿性條件下提取的高粱分離蛋白僅有5%～15%為醇溶蛋白組分[25]。此外，由表4 可知，堿性條件下MPI 發(fā)生蛋白質分子聚集的現(xiàn)象，大于85 ku 的蛋白條帶明顯高于其它試驗組。Valenzuela 等[26]認為在pH＞10 的堿性條件下，藜麥蛋白結構發(fā)生明顯的聚集現(xiàn)象。就碳水化合物類酶而言，雙酶法及三酶法條件下，MPI 分子質量分布情況沒有明顯差異，與單淀粉酶法略有不同。

圖2 不同提取方法的MPI 的SDS 電泳圖Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis of MPI extracted by different extraction techniques

表4 不同提取方法的MPI 分子質量分布Table 4 Molecular weight distribution as a percentage of MPI extracted by different extraction techniques

2.1.3 小米分離蛋白二級結構 利用FTIR 分析不同提取方法的MPI 的二級結構信息（表5）。FTIR 可通過去卷積、二階求導、曲線擬合等方式獲得蛋白質酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）中的信息，分析出蛋白質的α 螺旋（1 658～1 650 cm-1）、β折疊（1 640～1 610 cm-1）、β 轉角（1 700～1 660 cm-1）、無規(guī)卷曲（1 650～1 640 cm-1）結構[14]。

β 折疊是多肽鏈的一種伸展結構，往往與蛋白質的聚集以及天然結構破壞有關，而α 螺旋結構往往與蛋白質的天然結構存在聯(lián)系[14]。當?shù)鞍踪|發(fā)生變性時，蛋白質分子由卷曲態(tài)變?yōu)樯煺箲B(tài)，α 螺旋含量變少，同時β 折疊及β 轉角含量增加，無規(guī)卷曲結構指沒有規(guī)則的多肽構象[27-28]。

從表6 可知，5 種酶法提取條件對小米二級結構無顯著影響，β 折疊及β 轉角是MPI 主要的二級結構。堿法條件下，小米分離蛋白α 螺旋結構值最小，β 折疊結構值最大，說明相比于酶法，堿法提取的MPI 酰胺基間的氫鍵作用力降低，分子間靜電斥力的增加[29]。提取方法不同，α 螺旋/β 折疊比例不同，即具體的提取條件影響蛋白質的二級結構信息[30-31]。

表5 不同提取方法的MPI 二級結構（%）Table 5 Proportions of secondary structures of MPI extracted by different extraction techniques（%）

綜上所述，堿溶酸沉法條件劇烈，不利于保持蛋白的天然結構。相比而言酶法條件更為溫和，然而同樣因強堿環(huán)境下不利于除谷蛋白外其余蛋白組分的提取。α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶法（提取方法4）所得MPI 提取率、蛋白含量高，且較大程度地保留了小米蛋白的結構信息，因此對α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶法進行后續(xù)條件的優(yōu)化，以期獲得蛋白含量更高的MPI。

2.2 酶法提取小米分離蛋白單因素條件

為了提高MPI 的蛋白質含量，選取料液比1∶7，粉碎目數(shù)60，pH 5.0，酶解溫度50 ℃，加酶量2%，酶解時間12 h 條件，改變其中1 個因素，保持其它參數(shù)不變，分析各因素指標變化對蛋白質提取率的影響，結果見圖3。

1）由圖3a 可知，當料液比1∶7 時，MPI 的蛋白質含量最高，（58.27±0.69）%。當料液比再增加時，MPI 的蛋白質含量反而下降。這可能是由于料液比較大時，存在的濃度差促使傳質推動力增大，也就是說更多非蛋白可溶性物質溶出，從而影響MPI 蛋白質含量[32]。最終選擇料液比1∶7 為最佳的料液比，做后續(xù)試驗。

2）由圖3b 可知，粉碎目數(shù)為80 目時，MPI的蛋白質含量最高。同樣，當粉碎目數(shù)增加，小米內非蛋白可溶性物質與溶劑的接觸面增加，這導致MPI 蛋白質含量下降。最佳粉碎目數(shù)為80 目。

3）考慮到α-淀粉酶、糖化酶及復合纖維素酶的最適pH 值略有不同，有必要對蛋白提取環(huán)境的pH 值進行優(yōu)化。由圖3c 可知，當溶液pH 值由4.0 升至4.5 時，蛋白質含量顯著提高，而后隨著pH 值的增加而緩慢下降。溶液pH 值與蛋白質等電點的關系決定了蛋白質表面電荷的分布情況以及與蛋白水分子間的相互作用力[33]。已知小米蛋白的等電點4.0 左右，此時MPI 蛋白質含量不僅與不同pH 值下3 種酶的酶活有關，也與MPI 的溶解性有關。反應最適pH 4.5。

4）由圖3d 可知，當溫度50 ℃時，MPI 蛋白質含量到達最大值（62.84±0.49）%；當溫度低于或高于50 ℃時，蛋白質含量均下降。同樣的，復合酶體系溫度的確定十分重要，要保證該溫度下3 種酶均有相當強的活性，溫度過高或過低均影響酶促反應的進行。在單因素優(yōu)化試驗中，保持蛋白提取在50 ℃環(huán)境條件下進行。

5）由圖3e 可知，加酶量在0.5%～2.0%時，蛋白質含量隨酶量的增加而增加，當加酶量2.0%時可獲得蛋白質含量最高的MPI。加酶量繼續(xù)增加（＞2.0%），MPI 中蛋白質含量呈下降趨勢。當反應系統(tǒng)中的酶少量存在時，體系處于酶反應動力學的初級階段，所有的酶全部參與到反應中，2%的加酶量即達到飽和狀態(tài)[11]。由于反應體系中底物量（小米脫脂粉）是一定的，加酶量繼續(xù)增加并不會促進酶促反應的進行。最優(yōu)加酶量設定為2%。

6）由圖3f 可知，添加復合酶的0～12 h 內，MPI 的蛋白含量顯著升高，酶解12 h 獲得最高蛋白含量的MPI，（66.65±1.02）%。當酶解時間超過12 h 時，時間不再成為影響蛋白含量的主要因素。最終選擇酶解時間為12 h。

2.3 響應面設計與結果

利用Design-expert 8.0 軟件對表6 的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到MPI 蛋白質含量Y 對4個自變量X1、X2、X3、X4的二次多項回歸方程：Y=66.24 +14.48X1-2.59X2+11.37X3+3.07X4+0.21 X1X2+5.15X1X3-0.32X1X4-4.14X2X3-2.64X2X4-0.21 X3X4-17.32X12-10.93X22-14.08X32-7.25X42。響應面分析試驗方差分析結果見表7。

圖3 不同因素對小米分離蛋白蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of different factors on the protein content of millet protein isolate

表6 響應面設計及試驗結果Table 6 Program and experimental results of Box-Behnken test

表7 回歸模型方差及可信度分析Table 7 Analysis of variance and reliability of regression model

由表7 可看出，回歸模型P＜0.0001，此二次回歸方程模型差異極顯著，模型的相關方程能夠正確反應酶法提取MPI 蛋白含量與各因素之間的關系。失擬項P=0.0813＞0.05，表示其不顯著，試驗誤差小，模型相關系數(shù)R2=0.9872，R2Adj=0.9744，說明回歸模型與實際試驗擬合較好，不存在其它未考慮的影響因素?？衫么嘶貧w方程對MPI 蛋白含量進行分析、預測。

由表7 可知，X1，X2，X3，X4，X12，X22，X32，X42顯著影響小米總蛋白含量，說明選取的4 個因素對小米分離蛋白蛋白含量的影響成非簡單的線性關系，二次項同樣對響應值影響顯著。此外X1X3，X2X3，兩兩交互項對響應值也影響顯著（圖4）。響應面的陡峭程度隨pH 值、加酶量的變化起伏較大，說明pH 值、加酶量對蛋白含量的影響大于反應溫度和時間，該分析與表7 中方差分析結論一致。

為進一步確定三酶法提取高蛋白含量MPI 的最佳工藝，運用Design Expert 8.0.6 分析回歸方程，得到最佳工藝條件為：pH 4.7，酶解溫度48℃，加酶量2.2%，酶解時間10 h，此條件下預期的蛋白質含量69.11%，實際測得MPI 蛋白含量為（69.49±0.23）%，與預測值接近，偏差小，說明回歸模型具有準確性和實用性。在該最佳條件下，對酶解后產(chǎn)物進行透析處理，將酶解后淀粉水解產(chǎn)生的小分子雜質除去，大分子蛋白截留在透析袋中，隨后對透析后的MPI 進行蛋白質含量測定，可得蛋白質含量為（73.56±0.18）%。該方法較其它MPI提取方法有明顯優(yōu)勢[5，11，34-35]。

3 結論

相比于堿溶酸沉法，酶法特異性強，條件相對溫和，對蛋白質分子結構影響小，且蛋白提取率顯著高于堿法。通過分析單酶法、雙酶法及三酶法條件下的MPI 的分子質量分布、二級結構、提取率以及蛋白質含量，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶法能較完整地提取小米蛋白的信息，此時蛋白質含量最高。

圖4 各交互作用對MPI 蛋白含量影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots of the interaction of various factors on the MPI protein content

通過回歸分析確定α-淀粉酶/糖化酶/復合纖維素酶法提取高蛋白含量MPI 的最佳pH 4.7，酶解溫度48 ℃，加酶量2.2%，酶解時間10 h。該處理條件下蛋白質含量達（69.49±0.23）%，較其它MPI 提取方法優(yōu)勢明顯。