糜唯鈺，段 諾，吳世嘉，姬 華，王周平

（石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子832003）

β-苯乙胺是一種重要的芳香族生物胺，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，存在于哺乳動物組織中，高濃度的β-苯乙胺會導(dǎo)致β-內(nèi)啡肽釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生去甲腎上腺素，從而引發(fā)高血壓和偏頭痛等癥狀[1]。在奶酪、巧克力和腌制肉等食品中都存在β-苯乙胺。其潛在的毒性和作為食品質(zhì)量標(biāo)記的可能性，有必要對食品中的β-苯乙胺進行檢測。對β-苯乙胺檢測技術(shù)的研究在國內(nèi)外已經(jīng)開展多年，目前已建立多種檢測方法，其中最主要的是基于分離技術(shù)的儀器分析法，例如高效液相色譜（HPLC）[2-5]，氣相色譜（GC）[6-9]和毛細管電泳（CE）[10-12]等。這些方法可對β-苯乙胺進行精確的定量分析，然而也受到一些因素的限制，如儀器價格昂貴，檢測耗時較長以及需要專門技術(shù)人員操作等。

核酸適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），篩選獲得的一種單鏈寡核苷酸（ssDNA 或RNA），可折疊形成三級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可特異性識別并結(jié)合靶標(biāo)。核酸適配體不僅具有與抗體相似的親和力和特異性，而且還具有其它優(yōu)點，例如更短的合成時間，更低的制造成本，更少的批次間差異性，更高的可修飾性，更好的熱穩(wěn)定性以及更廣泛的目標(biāo)種類[13-15]?；诖耍怂徇m配體被廣泛用于臨床診斷和治療劑[16-18]，食品安全檢測[19-21]和環(huán)境監(jiān)測[22-24]等眾多領(lǐng)域。

小分子靶標(biāo)適配體的篩選大都采用在固相材料表面固定靶標(biāo)分子的SELEX 技術(shù)，該技術(shù)存在固定操作復(fù)雜，固相材料的空間位阻和靶標(biāo)分子構(gòu)象可能改變等缺點?；诠潭╯sDNA 文庫的捕獲SELEX（Capture-SELEX）無需固定靶標(biāo)分子，避免了上述問題，更適用于可溶性小分子靶標(biāo)核酸適配體的篩選[25-27]。Capture-SELEX 技術(shù)通過特別設(shè)計的一段生物素化的反義寡核苷酸鏈，與核酸適配體篩選文庫固定區(qū)域的一端互補結(jié)合，從而將ssDNA 文庫固定在抗生物素蛋白包被的磁珠表面。篩選過程中，能夠與靶標(biāo)形成復(fù)合物的適配體從磁珠表面解離，通過收集上清，PCR 擴增，制備單鏈等步驟[28-30]，獲得下一輪篩選的次級文庫。經(jīng)多輪篩選，就可獲得對靶標(biāo)具有高親和力和特異性的適配體。

迄今為止，特異性結(jié)合β-苯乙胺的ssDNA 適配體尚無報道。本研究通過Capture-SELEX 技術(shù)篩選對β-苯乙胺具有高親和力和特異性的ssDNA 適配體，并采用基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的熒光法驗證其親和力與特異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ssDNA 文庫，美國Integrated DNA Technologies（IDT）公司；正向引物P1、磷酸化反向引物P2、生物素標(biāo)記的互補鏈P3、dNTP mix 和Taq plus DNA 聚合酶（200 U/mL）等，生工生物工程（上海）股份有限公司；β-苯乙胺和酪胺，美國Sigma-Aldrich 公司；酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺、多巴胺，阿拉丁試劑（上海）有限公司；GO，南京先豐納米材料科技有限公司；Lambda 核酸外切酶（5 000 U/mL），New England BioLabs 生物公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，上海捷瑞生物有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；尿素【CO（NH2）2】、醋酸鈉（CH3COON a）、氯化鉀（KCl）、氯化鎂（MgC12）和氯化鈉（NaCl）等，均為分析純級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。參照Duan 等[31]的方法制備親和素包被磁珠。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平分析天平（AR224C），奧豪斯儀器中國有限公司；臺式高速冷凍離心機（Centrifuge 54248），德國Eppendorf 公司；分光光度計【UVVis（NIR）UVProbe 2.33 版】，日本島津公司；紫外-可見分光光度計（NanoDrop-2000 微量），美國Thermo Scientific 公司；擴增儀（C 1000 Thermocycler），美國Bio-Rad 公司；垂直電泳系統(tǒng)（Powerpac Basic Power Supply）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM EZ Image），美國Bio-Rad 公司；熒光實時定量PCR 儀（7900HT），美國ABI 公司；多功能酶標(biāo)儀（Synergy H1），美國BioTek 公司。

1.3 方法

1.3.1 隨機ssDNA 文庫和引物的構(gòu)建 核酸如表1所示，人工構(gòu)建合成長度為80 nt 的隨機ss-DNA 文庫，中間為40 nt 的隨機序列區(qū)，兩端固定序列各20 nt，作為PCR 的引物結(jié)合區(qū)域，該ssDNA 文庫容量在1014以上。

表1 本研究用DNA 序列Table 1 The DNA sequences used in this study

1.3.2 Capture-SELEX 的篩選流程 Capture-SELEX 篩選流程如圖1所示。

1）文庫固定 設(shè)計一條與隨機ssDNA 文庫引物區(qū)互補的互補鏈P3，將其進行生物素標(biāo)記。第1 輪篩選將1 000 pmol ssDNA 文庫與P3 以物質(zhì)的量比1∶1.5 加入1 mL 結(jié)合緩沖液（Binding buffer，BB）（50 mmol/L Tris-HC1，5 mmol/L KC1，100 mmol/L NaCI，1 mmol/L MgC12，pH 7.4）中，95 ℃變性10 min，在緩慢降溫至37 ℃過程中互補雜交3 h。互補后ssDNA 文庫與親和素包被磁珠以質(zhì)量比1∶300 孵育結(jié)合，37 ℃，130 r/min 反應(yīng)6 h，通過親和素與生物素的特異性結(jié)合，將ssDNA 文庫固定在磁珠上，用BB 緩沖液清洗3 次以上，去除非特異性結(jié)合的ssDNA。孵育結(jié)合前、后，采用紫外分光光度法測定上清液中DNA 的紫外吸收，驗證ssDNA 文庫的固定情況。

2）孵育 第1 輪篩選體系為1 mL，固定ss-DNA 文庫的磁珠與靶標(biāo)（β-苯乙胺，初始濃度為0.1 mmol/L）37 ℃孵育2 h，與靶標(biāo)特異性結(jié)合的ssDNA 從磁珠上解離下來，在緩沖液中形成ssDNA-靶標(biāo)復(fù)合物。從第2 輪開始，篩選孵育體系為300 μL，每輪的篩選條件如表2所示。隨著篩選輪數(shù)的增加，為獲得高親和力的適配體，逐漸增加篩選壓力，包括減少ssDNA 文庫用量，靶標(biāo)的濃度以及孵育時間。此外，為了提高適配體的特異性，從第5 輪開始進行反篩，加入靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)類似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺作為反篩靶標(biāo)與ssDNA 文庫孵育，棄包含反篩靶標(biāo)-ssDNA 復(fù)合物的上清液，清洗磁珠后再加入靶標(biāo)孵育。反篩，可以去除與靶標(biāo)結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合的ssDNA。

3）PCR 擴增 在外加磁場作用下，收集與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA，作為模板進行PCR 擴增。

4）酶切 PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒純化后，用Lambda 核酸外切酶酶切PCR 產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物用酚氯仿抽提法進行純化，乙醇沉淀法回收，獲得下一輪篩選的次級文庫。用NanoDrop 微量紫外-可見分光光度計測定其核酸濃度。

圖1 Capture-SELEX 的篩選流程圖Fig.1 The selection procedure of Capture-SELEX

表2 Capture-SELEX 的篩選條件Table 2 The selection conditions in each round of SELEX

1.3.3 熔解曲線監(jiān)測適配體富集 采用熔解曲線監(jiān)測適配體在篩選過程中的富集情況。實時定量PCR 使用SYBR Green 染料。20 μL 反應(yīng)體系中含10 μL SYBR Green Master Mix，引物P1 和P2（10 μmol/L）各0.4 μL。以1 μL 富集的文庫作為模板，超純水8.2 μL。PCR 方案：95 ℃預(yù)變性5 min，40 個循環(huán)，95 ℃10 s，60 ℃30 s。熔解曲線從軟件7 900 v 2.4 獲得，以此說明適配體篩選過程中的富集程度。

1.3.4 克隆測序及序列分析 最終獲得的ssDNA文庫經(jīng)PCR 擴增，送生工生物工程（上海）股份有限公司克隆、測序。將測序獲得的40 條序列，用DNAMAN V6 軟件分析其同源性，用Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/）預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)并計算自由能（△G）。根據(jù)序列同源性，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)相似性，挑選出重復(fù)性高或△G 較低的序列共8 條。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成5' 端標(biāo)記熒光素亞酰胺（FAM）基團的序列，用于后續(xù)親和力和特異性試驗。

1.3.5 親和力和特異性試驗 基于氧化石墨烯（GO）可吸附熒光標(biāo)記的核酸適配體序列（ssDNA），不能吸附核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的復(fù)合物的原理構(gòu)建熒光法測試適配體親和力[32]。取不同濃度（10～200 nmol/L）適配體溶液100 μL，95 ℃變性10 min，立即冰浴。加入β-苯乙胺（10 μmol/L）于37 ℃震蕩孵育2 h。孵育后加入最佳質(zhì)量比（GO 與適配體的質(zhì)量比為50∶1）的GO 震蕩孵育30 min，吸附未與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA。在4 ℃條件下，13 000 r/min 離心15 min，用Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀測定上清液的熒光強度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm），以無菌水代替靶標(biāo)作為陰性對照。通過GraphPad Prism 7.0 軟件擬合相對熒光強度（△F）對不同濃度適配體的非線性飽和結(jié)合曲線，計算解離常數(shù)（Kd值）。

式中：F——試驗組的熒光強度；F0——陰性對照組的熒光強度。

對親和力較強的候選適配體進行特異性試驗。分別將靶標(biāo)及其結(jié)構(gòu)類似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺（10 μmol/L）與適配體孵育，再與GO 震蕩孵育后測定其熒光強度。通過計算和比較相對熒光比例評估適配體的特異性，其中相對熒光比例=△F試驗組/△F靶標(biāo)，△F試驗組為加入靶標(biāo)和結(jié)構(gòu)類似物試驗組與陰性對照組熒光強度差值，△F靶標(biāo)為靶標(biāo)試驗組與陰性對照組熒光強度差值。以上試驗均做3 次平行重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ssDNA 文庫的固定

ssDNA 文庫與生物素標(biāo)記互補鏈P3 雜交互補后，通過生物素和親和素的特異性結(jié)合將ssDNA 文庫固定到磁珠表面，用于后續(xù)篩選。因ss-DNA 在波長260 nm 處有特征吸收峰，故文庫的固定通過紫外分光光度法測定。如圖2所示，固定前測得文庫在260 nm 處的吸光度為0.843，固定后上清液吸光度為0.170，表明文庫全部被固定至磁珠表面。

2.2 溶解曲線監(jiān)測適配體篩選的富集

Capture-SELEX 篩選中，采用溶解曲線監(jiān)測適配體的富集程度。溶解曲線分析與SELEX 方法及靶標(biāo)性質(zhì)無關(guān)，可作為不同SELEX 篩選方法的通用監(jiān)測工具，并可應(yīng)用于不同靶標(biāo)（小分子、蛋白質(zhì)、細菌和癌細胞）適配體的篩選。PCR 產(chǎn)物的溶解溫度取決于其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和雙鏈體的穩(wěn)定性。文庫在PCR 過程中會形成異源雙鏈和同源雙鏈，其比例取決于序列的多樣性。隨著篩選的進行，與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA 不斷富集，次級文庫的序列多樣性降低。PCR 過程中會形成更多較穩(wěn)定的同源雙鏈，其溶解溫度更高。如圖3所示，溶解溫度在第18 輪達到最大值，表明適配體在篩選過程中已經(jīng)富集。

圖2 ss-DNA 文庫固定磁珠前、后的紫外吸收圖Fig.2 UV-visible of ss-DNA library before and after immobilized magnetic beads

圖3 Capture-SELEX 篩選2～18 輪的熔解曲線Fig.3 Melting curve of aptamer pool from 2-18 Capture-SELEX rounds

2.3 β-苯乙胺適配體序列分析

將第18 輪ssDNA 文庫克隆測序，共獲得40條序列。根據(jù)DNAMAN V6 和MFold 的分析結(jié)果，挑選出重復(fù)性高或△G 較低的序列共8 條，作為候選適配體（表3），用作后續(xù)親和力試驗。

表3 β-苯乙胺候選適配體序列Table 3 The sequences of aptamer candidates binding to β-phenylethylamine

2.4 親和力和特異性試驗

GO 的2D 表面結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的能量轉(zhuǎn)移能力使其能夠通過π-π 堆積或氫鍵相互作用強烈吸附生物分子，并通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）機制對附近熒光物質(zhì)進行熒光猝滅[33]。如圖4所示，5'端標(biāo)記FAM 基團的適配體和靶標(biāo)孵育后，與靶標(biāo)結(jié)合的適配體形成三維構(gòu)象，無法與GO 穩(wěn)定吸附結(jié)合，熒光基團不會被淬滅。而未與靶標(biāo)結(jié)合的適配體穩(wěn)定吸附在GO 表面，這是由于FRET 機制FAM 基團的熒光被淬滅。經(jīng)離心分離操作，上清液為靶標(biāo)-ssDNA 復(fù)合物，測定其熒光強度。

圖4 基于GO 熒光分析法驗證適配體親和力的原理Fig.4 The principle of verifying the affinity of aptamers based on GO fluorescence method

2.4.1 氧化石墨烯添加量及孵育時間優(yōu)化 為了保證GO 能完全吸附適配體，需要優(yōu)化試驗中GO的添加量。如圖5所示，隨著GO 的增加，體系中的熒光強度降低。F 為添加GO 孵育后的熒光強度，F(xiàn)0為未添加GO 時體系的熒光強度。當(dāng)GO 與適配體的質(zhì)量比為50∶1 時，適配體基本被GO 吸附，熒光淬滅。將GO 與適配體的質(zhì)量比為50∶1作為后續(xù)試驗中GO 的最佳用量。通過動力學(xué)曲線優(yōu)化GO 與適配體的孵育時間。如圖6所示，孵育時間30 min 時，熒光強度幾乎被完全淬滅，因此GO 與適配體的最佳孵育時間為30 min。

圖5 GO 濃度優(yōu)化Fig.5 Optimize GO concentration

圖6 GO 孵育時間優(yōu)化Fig.6 Optimize GO incubation time

2.4.2 β-苯乙胺適配體親和性試驗 采用GO 熒光法測定β-苯乙胺8 條候選適配體序列的親和性，Kd值越小，該序列親和力越強。由圖7 可知，適配體PHE-1、PHE-2 和PHE-8 對β-苯乙胺親和力較強，Kd值分別為（67.54±15.88），（71.64±11.47），（80.46±12.57）nmol/L。選取上述候選適配體繼續(xù)做特異性試驗。

圖7 GO 熒光法驗證β-苯乙胺候選適配體結(jié)合飽和曲線Fig.7 The saturation curves of candidate aptamer toward β-phenylethylamine by GO fluorescence method

2.4.3 β-苯乙胺適配體特異性試驗 為了進一步驗證篩選核酸適配體的特異性，進行了反篩。反篩靶標(biāo)酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺與β-苯乙胺結(jié)構(gòu)相似，且可能同時存在于檢測體系中干擾檢測。選擇親和力好的PHE-1、PHE-2和PHE-8 適配體與上述物質(zhì)結(jié)合，以驗證其特異性。如圖8所示，PHE-1 對酪胺具有一定的結(jié)合能力，PHE-2 和PHE-8 特異性較好，并且適配體PHE-2 的Kd值較低【（71.64±11.47）nmol/L】，因此篩選獲得的PHE-2 序列可作為與β-苯乙胺高親和力和特異性結(jié)合的適配體。

圖8 GO 熒光法驗證適配體PHE-1、PHE-2和PHE-8 的特異性Fig.8 The specificity of aptamer PHE-1，PHE -2 and PHE-8 verified by GO fluorescence method

3 結(jié)論

采用Capture-SELEX 篩選小分子靶標(biāo)β-苯乙胺的適配體，將第18 輪的PCR 產(chǎn)物克隆測序，共獲得40 條序列。分析序列的同源性和二級結(jié)構(gòu)，挑選出8 條候選適配體序列。采用GO 熒光法進行適配體親和力和特異性試驗。最后獲得一條特異性識別β-苯乙胺的適配體（PHE-2），Kd=（71.64±11.47）nmol/L，表明基于Capture-SELEX技術(shù)成功篩選到β-苯乙胺適配體PHE-2，為研究和開發(fā)β-苯乙胺的分析檢測方法提供了新思路。