蔡海鶯，盛宇華，沈靈智，李嘉嘉，李 靜，林萌慧，陳 曲，蔡成崗，馮鳳琴

（1 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 杭州310023 2 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058）

甜米酒歷史悠久，是我國飲食文化的重要組成部分。中國甜米酒主要以糯米為發(fā)酵原料，在自然條件下通過霉菌、細(xì)菌和酵母混合發(fā)酵釀制而成。甜米酒具有柔和綿長的香氣和口感，營養(yǎng)價值較高。除糯米自身營養(yǎng)成分經(jīng)發(fā)酵后易于被人體消化吸收外，還包含釀制過程中產(chǎn)生的功能性多肽、氨基酸、多糖、低聚糖、維生素等。多酚化合物是植物性食物的天然成分，與食物的感官特性有關(guān)，如風(fēng)味和顏色。近年來，膳食多酚因其清除自由基，調(diào)節(jié)消化酶和螯合金屬等生物活性而受到越來越多的關(guān)注[1-2]。研究表明，食用多酚類化合物可能有助于預(yù)防各種疾病，包括眼科、心血管和消化系統(tǒng)故障、糖尿病、動脈粥樣硬化、衰老，甚至過敏、腫瘤發(fā)生和病毒感染等[3-4]。植物性食品中多酚的作用機(jī)理可能隨著多酚組分的變化而變化，其中抗氧化活性是研究最多的重要功能之一。

發(fā)酵能在一定程度上改善甜米酒的營養(yǎng)，同時還有利于提高其多酚組分的釋放和生物利用度。混合微生物種群（包括酵母菌、霉菌和細(xì)菌）發(fā)酵產(chǎn)生的酶、酒精和其它分子，通過多種途徑促進(jìn)多酚化合物的釋放，同時還能改善甜米酒風(fēng)味物質(zhì)形成和消化性能[5]。Xu 等[6]通過傳統(tǒng)的蒸汽法進(jìn)行糯米糊化釀制，獲得的米酒多酚含量達(dá)到479.67 mg/L（沒食子酸當(dāng)量）。此外，酒中的多酚化合物在體內(nèi)具有較高的生物利用度[7-8]，這是因為酒類發(fā)酵過程產(chǎn)生大量水解酶，將植物原料中的多酚化合物從其糖苷或其它結(jié)合物中釋放出來，從而有效提高游離多酚含量和其抗氧化活性。

前期的研究表明，不同酒曲發(fā)酵劑對甜米酒最終的品質(zhì)和風(fēng)味等方面產(chǎn)生了重要影響[9]。然而，不同原料對米酒發(fā)酵的酚類及其抗氧化活性的影響鮮見研究報道。本文采用6 種大米原料，通過傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝釀制甜米酒，對米酒終產(chǎn)物的總多酚含量、主要酚類成分及其抗氧化活性進(jìn)行研究和相關(guān)性分析，旨在為米酒的生物釀制，營養(yǎng)和功能性優(yōu)化等提供一定的理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：黃米、紅米、長糯米、紫米、黑米和圓糯米以及酒曲（AQ4）均購于杭州本地超市。

抗壞血酸、2，2-嗪-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）和乙二胺四乙酸（EDTA）均為分析純試劑，Sigma Aldrich（中國上海）。福林酚試劑、生物試劑，上海國藥化學(xué)試劑有限公司。異阿魏酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆素酸、芥子酸、阿魏酸均為色譜純試劑，阿拉丁工業(yè)公司。

用甲醇制備1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)酚類溶液，在-80℃下儲存。在樣品緩沖液（1.25%冰醋酸，7%甲醇雙蒸餾水）中稀釋后立即使用工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計（SP-756），上海光譜儀器有限公司；水浴氮吹儀（JC-S24），青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；高效液相色譜儀（Waters E2695），美國Waters 公司；臺式高速離心機(jī)（H1850），湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（ZWPA1230）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C），上海智城分析儀器制造有限公司；恒溫水浴鍋（HH-8），常州澳華儀器有限公司。

1.3 甜米酒釀制過程

甜米酒的釀制方法參考文獻(xiàn)[9]，發(fā)酵過程分5 步：浸泡大米、蒸米、冷卻、添加發(fā)酵劑并攪拌均勻后發(fā)酵。將100 g 糯米浸泡在150 mL 水中，在25 ℃下浸泡1 h，然后蒸米20 min，使糯米淀粉糊化。將蒸好的大米冷卻至30 ℃，放入500 mL 燒杯中。將發(fā)酵劑加入每個樣品中，在30 ℃下靜態(tài)發(fā)酵120 h。從發(fā)酵混合物中收集所有樣品酒液，然后在室溫下以6 000 r/min 速度離心10 min。上清液用于測定多酚含量、主要酚類成分和抗氧化活性。

1.4 甜米酒的理化性質(zhì)鑒定

以沒食子酸為參比化合物，采用Folin-Ciocalteu 法[10]對總多酚進(jìn)行評價。根據(jù)沒食子酸當(dāng)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，甜米酒總酚含量以mg/L 沒食子酸當(dāng)量計。取0.1 mL 樣品于10 mL 離心管中，補(bǔ)去離子水至0.5 mL，加入2.5 mL 10%福林酚試劑，常溫避光反應(yīng)3 min，然后加入2 mL 7.5% Na2CO3，放入搖床震蕩，25 ℃反應(yīng)1 h（轉(zhuǎn)速120 r/min），最后于波長765 nm 處測定吸光值。將測得的數(shù)據(jù)代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算待測樣品中總酚含量。

1.5 甜米酒的抗氧化活性測定

采用ABTS 自由基清除能力測定米酒樣品的自由基清除能力，試驗方法參考文獻(xiàn)[11]。具體步驟是：將米酒中的0.5 mL 甲醇提取物添加到新制備的4 mL ABTS 溶液中。將溶液混合并在25 ℃黑暗中培養(yǎng)30 min。在734 nm 處測量培養(yǎng)液的吸光度。使用0.5 mL 等份甲醇溶劑作為空白對照，米酒的自由基清除活性表示為mg/L 維生素C（VC）當(dāng)量。用鐵還原抗氧化能力（FRAP）測定法[12]評價米酒溶液的還原力。具體步驟是：將米酒0.5 mL 甲醇提取物添加到新制備的5 mL FRAP 試劑中，在波長595 nm 處測量吸光度。米酒的還原能力表示為mg/L Fe2+當(dāng)量。以上所用溶液均為現(xiàn)配。

1.6 甜米酒多酚的提取

根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行總多酚和游離多酚提取前處理。堿處理法用于米酒總多酚測定的前處理，即：用4.5 mL 2 mol/L NaOH 溶液（含10 mmol/L EDTA 和體積分?jǐn)?shù)1%VC）在30 ℃下水解0.5 mL 甜米酒樣品，處理時間30 min。水解完成后，用HCl 將樣品pH 值調(diào)至3.0，加入300 mg NaCl 和40 μg 異芥酸作為內(nèi)標(biāo)。與總多酚提取方法相比，游離多酚前處理不經(jīng)堿解處理。

米酒多酚的提取過程參考文獻(xiàn)[14]。分別用0.5 mL 水溶液和0.5 mL 含NaCl 的米酒液，用2 mL 乙酸乙酯經(jīng)3 次渦旋混勻提取，每次5 min。每輪提取后，樣品經(jīng)3 000 g 轉(zhuǎn)速離心10 min，收集有機(jī)相，通過氮吹揮發(fā)完全。最后，將干燥殘渣溶解于0.5 mL 甲醇。將制備的提取物用緩沖液適當(dāng)稀釋，過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。使用上述提取程序?qū)γ拙茦悠纷龌厥赵囼?，結(jié)果酚類化合物的回收率（92.1%～107.0%）較高。

1.7 甜米酒多酚化合物的HPLC 檢測

使用配備光電二極管陣列檢測器（PDA）的高效液相色譜（HPLC）檢測提取物中的酚類物質(zhì)。操作條件是：柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測器280 nm。在安捷倫C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）上進(jìn)行色譜分離。用流動相溶液A（雙蒸餾水含1.25%冰醋酸）和溶液B（甲醇）進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫程序：0～5 min，從85%溶液A和15%溶液B 到80%溶液A 和20%溶液B，線性梯度；6～25 min，從80%溶液A 和20%溶液B 到65%溶液A 和35%溶液B，線性梯度；26～35 min，從65%溶液A 和35%溶液B 到50%溶液A 和50%溶液B，線性梯度；36～45 min，20%溶液A 和80%溶液B；46～50 min，85%溶液A 和15%溶液B。

1.8 統(tǒng)計分析方法

所有測定3 個平行樣品，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。回歸分析采用SPSS 22.0（美國SPSS公司），組間差異通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey 多重比較確定。主要成分分析（PCA）采用SIMCA 14.1（瑞典UMetrics）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜米酒多酚總量

用不同原料大米進(jìn)行米酒釀制。表1 列出6種釀制米酒的總多酚含量，從144.53 mg/L 沒食子酸當(dāng)量到1 135.33 mg/L 沒食子酸當(dāng)量不等。其中，黑米酒（B2）總酚含量最高，其次是長糯米（L2）和紫米（P2），表明黑米是發(fā)酵高含量多酚米酒的首選原料。黃米酒中總酚含量最低，僅144.53 mg/L 沒食子酸物質(zhì)的量。試驗結(jié)果顯示：米酒中的多酚主要來源于發(fā)酵植物原料。除了發(fā)酵工藝和酒曲的影響外，不同的米酒原料顯著影響米酒的品質(zhì)參數(shù)，尤其是米酒的多酚含量。

表1 不同原料米酒的多酚含量和抗氧化性Table 1 The polyphenol content and antioxidant acitivity of different rice wines

2.2 甜米酒抗氧化活性

采用基于自由基清除能力的ABTS 法和基于鐵離子還原的FRAP 法對米酒進(jìn)行抗氧化活性評價。表1 列出6 種米酒的抗氧化活性值。不同稻米原料的米酒的抗氧化性差異顯著，米酒的ABTS值在351.27～3 736.31 mg/L VC 當(dāng)量之間，米酒的FRAP 值在58.48～205.07 mg/L Fe2+當(dāng)量之間。黑米發(fā)酵米酒雖然ABTS 清除能力略低，但是在FRAP 測定中顯示最高還原力，黑米是釀制最佳抗氧化活性米酒的首選原料，與總酚含量的結(jié)果一致。米酒總酚與抗氧化活性（ABTS 和FRAP 值）之間相關(guān)性分析顯示（圖1）：ABTS 檢測方法中，6 種大米原料的米酒抗氧化值與總多酚含量的線性相關(guān)系數(shù)為0.829（P=0.042）；FRAP 檢測方法中，6種大米原料的米酒總多酚含量與抗氧化活性呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.886（P=0.019）。米酒的自由基清除能力與其總多酚含量顯著有關(guān)，說明多酚為米酒抗氧化性的主要成分。另外，有研究也報道了包括白葡萄酒、紅葡萄酒、果酒和糯米酒等酒類的總多酚與抗氧化活性之間的正相關(guān)關(guān)系[6]。

2.3 甜米酒多酚化合物含量

不同米酒的多酚組成成分不同，酚類成分決定了米酒的質(zhì)量和風(fēng)味。采用HPLC 測定米酒樣品的多酚組成。米酒中酚酸多酚多以酯化形式存在。堿水解后收集的總多酚含量（游離和共軛形式）及游離酚含量見表2 和表3。分別列出不同大米原料米酒中游離多酚和總多酚化合物的含量，結(jié)果顯示，以黑米和紫米為原料發(fā)酵的米酒具有相似的多酚組成和含量，與其余4 種米酒差異較大。黑米酒和紫米酒中對羥基苯甲酸和芥子酸含量較高，而其它4 種米酒中這兩種成分含量較低。黑米酒中對香豆素酸含量明顯高于其它米酒。此外，所有米酒中香草酸是最豐富的多酚化合物，其次是阿魏酸。大多數(shù)肉桂酸和苯甲酸多酚以酯化或糖基化形式存在，經(jīng)NaOH 溶液處理后可水解為游離多酚，導(dǎo)致相應(yīng)多酚含量增加。沒食子酸、3，4-二羥基苯甲酸、咖啡酸和丁香酸經(jīng)堿處理后急劇增加，而對香豆素酸和阿魏酸的增量相對較低，說明不同多酚的結(jié)合酚含量與總酚含量的比值不同。

圖1 不同米酒總酚與抗氧化性相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between polyphenol contents and antioxidant acitivities of different rice wines

與Folin-Ciocalteu 法測定的總酚含量結(jié)果相似，不同大米原料的米酒多酚含量有顯著差異，游離多酚和總多酚的最低值分別為19.16 mg/L 和26.33 mg/L，最大值分別為49.74 mg/L 和72.71 mg/L。采用主成分分析法（PCA）對米酒樣品的多酚譜進(jìn)行數(shù)據(jù)相似性和差異性的可視化分析。PCA 結(jié)果與生化分析的結(jié)果類似，即不同原料的米酒多酚譜差異較為顯著（圖2）。L2、O2、R2 和Y2 樣品在主成分PC1 軸上的位置接近，表明它們的多酚組成相似，均含有丁香酸、香草酸和沒食子酸；P2 和B2 組成成分差異較顯著。在主成分PC2軸上，B2、O2、R2 和Y2 樣品的分布也很接近，表明其含有部分相同成分和含量，包括對香豆酸、芥子酸和綠原酸。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)的HPLC 法檢測到的米酒樣品中多酚含量與福林酚法檢測的總多酚含量之間存在明顯的差異，該結(jié)果與紅酒和白葡萄酒中膳食纖維結(jié)合多酚研究結(jié)果一致[15]，表明大多數(shù)米酒多酚可與膳食纖維結(jié)合，在小腸中生物利用度較低。根據(jù)食物多酚的酶消化和結(jié)腸發(fā)酵的體外胃腸模型，腸道微生物群具有復(fù)雜的酶系統(tǒng)，大多數(shù)與膳食纖維結(jié)合的不可提取多酚在結(jié)腸中具有較高的生物利用度，并具有改善腸道微生態(tài)健康的作用[16-17]。除了對人體健康的多重益處外，多酚的抗氧化活性對酒類自身的抗衰老特性和最終的酒品質(zhì)同樣重要[18]。另外，一定量的多酚還有利于酒體的醇香和質(zhì)地的形成，然而，米酒中過量的多酚往往通過與蛋白質(zhì)分子的相互作用導(dǎo)致非生物混濁和沉淀[19]，尤其是分子質(zhì)量較大的聚合多酚。此外，過多的多酚會導(dǎo)致米酒的澀味、苦味和暗色[20]。了解多酚的作用和影響機(jī)制，優(yōu)化多酚的組分和含量，對米酒最終品質(zhì)有著重要的影響。

綜上所述，在相同發(fā)酵條件和酒曲發(fā)酵劑下，6 種原料的米酒在總多酚含量、酚類物質(zhì)和抗氧化活性方面差異顯著。其中，黑米是釀制高含量多酚和抗氧化活性米酒的最佳選擇。研究顯示米酒中的多酚主要來源于發(fā)酵的植物原料。米酒發(fā)酵可能通過調(diào)節(jié)酶、代謝物與酚類化合物的相互作用加速多酚的釋放。在對米酒進(jìn)行營養(yǎng)和功能優(yōu)化時，必須綜合考慮米酒原料、酒曲以及發(fā)酵工藝等技術(shù)因素及其它們之間的相互作用。

表2 不同原料米酒的游離多酚譜（mg/L 沒食子酸當(dāng)量）Table 2 Free polyphenolic profiles of different rice wines（mg/L gallic acid equivalents）

表3 不同原料米酒的總多酚譜（mg/L 沒食子酸當(dāng)量）Table 3 Total polyphenolic profiles of different rice wines（mg/L gallic acid equivalents）

圖2 不同原料米酒的多酚譜主成分分析Fig.2 Principal component analysis of phenolic profiles of different rice wines