朱勤超，馮俊麗，2*，戴志遠，2，汪 藝

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

組胺（histamine，HA）是在許多食物（例如葡萄酒、奶酪、蔬菜和魚類等）中以各種水平存在的一種生物胺（biogenic amine，BA）。大部分由生物胺造成的食源性中毒事件都與組胺有一定聯(lián)系[1]。低濃度組胺參與重要神經(jīng)生理功能的調(diào)節(jié)，如機體運動、體溫控制、膽固醇及膽汁酸代謝和免疫反應[2]。然而，食品和飲料中高濃度的組胺對人體具有毒性作用，會引起腹瀉、惡心、嘔吐、心悸、頭疼、心肌缺血和急性肺水腫等癥狀[3]。在食品加工和儲存期間，組胺通常由微生物對環(huán)境中游離的組氨酸進行脫羧反應而產(chǎn)生。反應中涉及的外源組氨酸脫羧酶由相關的微生物釋放。這些微生物有些存在于活魚的正常微生物菌群（主要是腸道細菌）中，然而大多數(shù)似乎來自漁船上、加工廠和運輸系統(tǒng)的污染[4]。除了衛(wèi)生條件外，食品加工方法的其它因素，如其儲存溫度和時間對組胺生成也有一定影響。

值得注意的是，食物中的組胺一旦形成通常不會被高溫破壞[5]。食品中組胺的存在及含量非常重要，它通常作為食品變質(zhì)的一個指標，也是食品生產(chǎn)加工、運輸和儲存過程中質(zhì)量控制、監(jiān)測的生物標志物之一[6]。

據(jù)文獻報道，目前鑒定、定量組胺的分析方法有：毛細管電泳技術[7-9]、氣相色譜[10-11]、薄層色譜[12]、高效液相色譜[13]、比色法和熒光法[14]等。這些方法成本高，耗時且需要復雜的設備，亟待構(gòu)建一種操作簡便、成本低廉、速度快、靈敏度高的組胺檢測方法。

適配體是由寡核苷酸隨機文庫通過指數(shù)富集篩選而獲得。適配體的體外選擇過程涉及特異結(jié)合，分離和擴增[15-16]。適配體可以靶向多種分子結(jié)構(gòu)，如金屬離子、生物毒素、蛋白質(zhì)、細菌和病毒等[17-19]。適配體折疊成不同的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，進而具有與抗體相當?shù)挠H和性和特異性，可識別相應目標物質(zhì)[20]。此外，與抗體相比，適配體具有以下幾個優(yōu)點[21-23]：快速可重復的合成，簡單可控的精確修飾，以滿足不同分析、臨床診斷和治療。其穩(wěn)定性好且可逆變性，至今未發(fā)現(xiàn)免疫原性，具有較長的保質(zhì)期。作為抗體替代物，新出現(xiàn)的適配體成為檢測特定靶標的理想識別元件，得到國內(nèi)外科研人員的廣泛研究[24]。

近年來，篩選用于分子質(zhì)量較小的靶標檢測的適配體方法主要包括磁珠法[25]、親和柱層析法[26]和氧化石墨烯法[27]等。本試驗中采用氧化石墨烯法作為ssDNA 篩選分離的指數(shù)富集方法，不需要改變組胺的化學結(jié)構(gòu)，不需要活化組胺并將其固定于載體上，只需將氧化石墨烯加入反應體系中吸附去除未與組胺結(jié)合的游離ssDNA，從而實現(xiàn)對食品中組胺適配體的篩選[28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺、氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、L-組氨酸鹽酸鹽、血清素、5-羥色胺，上海生工生物技術有限公司；高保真PCR 酶、50 bp DNA 標準品、瓊脂糖，大連寶生物工程（Takara）有限公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.2 隨機文庫構(gòu)建和引物合成

建立長度為81nt 的單鏈DNA 隨機文庫：5′AGT ATA CGT ATT ACC TGC AGC（N 40）CGA TAT CTC GGA GAT CTT GC 3′，兩端為固定序列，中間N40 為含40 個堿基的隨機序列。隨機ssDNA 文庫和引物均由上海生工生物工程有限公司合成。用TE 緩沖液配成濃度2 nmol/L 貯液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聚合酶鏈式反應（PCR）與瓊脂糖凝膠電泳

利用PCR 將每輪篩選獲得的ssDNA 作為模板進行擴增。反應體系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL（20 mmol/L），下游引物1 μL（20 mmol/L），2× 預混液10 μL，滅菌超純水6 μL，總體積為20 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)25 次，最后72 ℃延伸2 min。利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照分析，觀察電泳條帶是否單一，位置是否正確。

1.4 GO-SELEX 篩選方法

參考文獻[29]的方法，將氧化石墨烯加入反應體系中吸附去除未與組胺結(jié)合的游離ssDNA。本試驗中，將組胺溶于超純水，配成2 nmol/L 的溶液。配制15 mg/mL GO，超聲至均勻懸浮體系，使用前充分混勻。

在第1 輪篩選時，隨機ssDNA 文庫使用量為20 μL，組胺溶液用量為20 μL。首輪篩選體系為600 μL，在1 × 結(jié)合緩沖液（0.85% NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中25 ℃反應2.5 h，加入100 μL 氧化石墨烯吸附30 min，然后，13 000 r/min 離心10 min，取其上清液，重復3 次，充分去除殘留氧化石墨烯。將離心獲得的上清液作為PCR 擴增的模板，PCR 擴增所得ssDNA 通過純化、酶切、純化及變性后作為第2 輪篩選所需文庫。

為提高適配體篩選的特異性，每2 輪正篩后進行1 輪反篩，即分別在第3，6，9 輪用L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進行反向篩選。反篩過程與正篩基本相同，在結(jié)合反應結(jié)束后，離心收集不與反篩物結(jié)合的上清液，直接作為模板進行不對稱PCR 擴增。11 輪篩選所得ssDNA 經(jīng)純化，送至上海英駿生物技術有限公司序列分析。

1.5 適配體二級結(jié)構(gòu)模擬

用DNAMAN 軟件對測序獲得的序列進行比對，并用在線程序Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）進行二級結(jié)構(gòu)預測和模擬。

1.6 適配體結(jié)合特異性分析

氧化石墨烯不僅能強吸附游離的單鏈DNA，而且具有極好的熒光淬滅作用，能將吸附在其表面的熒光基團猝滅[29]。將測序所得序列通過分析挑選2 種代表性序列，在其5-端進行FAM 標記，分別與組胺、L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺在25 ℃搖床孵育2 h，加入GO 吸附并淬滅未結(jié)合的熒光標記ssDNA。反應結(jié)束后用F-7000 熒光光譜儀，在激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm，光電倍增電壓800 V 的條件下檢測孵育液的熒光強度（F）。共重復3 次試驗，以不加適配體的為空白對照組，不加靶標物并不用氧化石墨烯吸附的為陽性對照組。

1.7 適配體親和力測定

各適配體與HA 的親和常數(shù)測定方法是：將HA 與不同濃度的適配體（0～80 nmol/L）結(jié)合2 h，然后按照1.6 節(jié)方法計算不同濃度時的親和力，并以適配體濃度為橫坐標，親和力為縱坐標作圖。利用Origin 8.0 軟件擬合每條適配體的飽和曲線，計算其解離常數(shù)Kd值。

圖1 基于氧化石墨烯的組胺的SELEX 篩選原理圖Fig.1 SELEX of Histamine based on Graphene Oxide（GO）

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體篩選流程

第1 輪、第2 輪為正篩，以富集到更多的與組胺相結(jié)合的ssDNA。當富集的ssDNA 達到一定的數(shù)量，加入L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進行反篩，以增強適配體的特異性。經(jīng)11 輪SELEX 篩選，測序獲得15 條候選適配體序列，見表1。其中有6 個適配子的序列（HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14）在測序結(jié)果中出現(xiàn)5 次以上，是高頻適配子。

表1 測序得到的15 條適配體序列Table 1 15 Aptamer sequences by test

2.2 適配體一級結(jié)構(gòu)分析

使用DNAMAN 軟件對15 條序列進行多序列比對和同源性分析，得到相應的同源樹（圖2）。依據(jù)該同源樹將這15 條序列分成3 個家族（表2）。從表2 可看出，同源性較高的第1 家族集中了57.7%的適配體，大部分高頻出現(xiàn)的適配體在這個家族。這表明GO-SELEX 篩選具有很好的富集作用。

2.3 候選適配體的二級結(jié)構(gòu)分析

在測序結(jié)果中適配體出現(xiàn)的頻率越高，意味著其在富集庫中的占比越較高，對組胺的親和力也越高。從3 家族中選擇高頻出現(xiàn)的適配體HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14。利用在線程序Mfold 對這6 條高頻適配體序列的二級結(jié)構(gòu)進行預測和模擬。比較每個適配體的預測二級結(jié)構(gòu)的自由能，適配體序列二級結(jié)構(gòu)見圖3。

基于ssDNA 折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要通過自由能衡量，自由能越小，折疊結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[23]。對這6 條適配體的自由能進行比較，HAA-4 最小自由能為-6.87 kcal/mol，明顯小于其它5 條適配體的自由能，表明相比其它適配體，其二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。圖3 可見HAA-4 為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為1 個大環(huán)和2 個小環(huán)，而莖環(huán)結(jié)構(gòu)正是適配體與靶標組胺結(jié)合的基礎。

圖2 組胺適配體同源樹Fig.2 Homology tree of aptamers against Histamine

2.4 適配體特異性分析

所挑選的高頻適配子對HA 的結(jié)合特異性分析見圖4。HAA-4 和HAA-7 對HA 的親和特異性較高。后續(xù)只選HAA-4 和HAA-7 適配子進行親和常數(shù)的測定。

表2 基于同源樹的組胺適配體分類Table 2 Classification of aptamers against histamine based on the homology tree

圖3 預測的組胺適配體序列二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted secondary structures of Histamine aptamer sequences

圖4 4 種高頻適配體特異性分析Fig.4 Analysis of specificities of the four high-frequency aptamers

圖5 組胺適配體的解離常數(shù)飽和曲線Fig.4 Saturation curves of dissociation constant（Kd）of Histamine aptamer

2.5 適配體親和性分析

測定HAA-4 和HAA-7 適配子的親和常數(shù)，其中適配子HAA-4 的親和常數(shù)飽和曲線見圖5，呈較好的擬合效果，適配子與菌體之間的親和常數(shù)Kd=48.37 nmol/L。適配子HAA-7 的飽和曲線與圖4 類似，親和常數(shù)Kd=39.73 nmol/L。根據(jù)親和常數(shù)越小，適配體與靶標的親和力越大的原則，適配子HAA-7 對HA 的親和力更大。

3 結(jié)論

本研究中，利用基于氧化石墨烯的SELEX 技術，對組胺進行11 輪的篩選，分別在第3，6，9 輪用L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進行反向篩選，最終獲得高度親和性和特異性的15 條適配體序列。通過適配體二級結(jié)構(gòu)、親和性和特異性分析，最終HAA-4 和HAA-7 被確定為最佳候選適配體，有望用于食品中組胺的定性、定量分析。未來的工作是確定對組胺候選配體進行化學改性和修飾，開發(fā)基于對組胺精確識別的適配體的低成本、高靈敏的新型組胺檢測方法。