張振山 樂淵 黎舒懷 劉春華 李萍萍

摘要?[目的]建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測砂仁中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法。[方法]砂仁樣品先用含1%甲酸的乙腈溶液提取，再經(jīng)鹽析劑鹽析后加入MgSO4、PSA和C18進(jìn)行萃取、凈化，采用UPLC-MS/MS檢測，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量。[結(jié)果]目標(biāo)化合物在2.5～100.0 μg/L有良好的線性關(guān)系，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3個(gè)添加水平下，10種農(nóng)藥成分加標(biāo)回收率為70.7% ～ 113.3%，RSD為0.2%～4.9%（n=3）;定量限（LQD）在0.19～4.01 μg/kg。[結(jié)論]該方法操作簡單、凈化效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高，適用于砂仁藥材中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留檢測。

關(guān)鍵詞?砂仁;氨基甲酸酯類農(nóng)藥;QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號?S481+.8?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.053

Abstract?[Objective]To establish a method for the simultaneous determination of 10 carbamate pesticide residues in Amomum villosum Lour. by QuEChERS-ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Method]The samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）and followed by salting-out process， the extract was further purified by C18， PSA and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were then analyzed by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched standard calibration curve method. [Result]The target compound had a good linear relationship between 2.5-100.0 μg/L， R2≥0.999;at spiked levels of 0.02，0.08 and 0.40 mg/kg， the average recoveries of all the pesticides were 70.7% - 113.3%， and the RSD was 0.2% -4.9%（n =3） . The limits of detection（LOD） was 0.19 - 4.01 μg/kg. [Conclusion]The method has simple operation， good purification effect， high sensitivity and high accuracy， and is suitable for the detection of 10 carbamate pesticide residues in Amomum vilosum Lour..

Key words?Amomum villosum Lour.;Carbamate pesticide;QuEChERS-UPLC-MS/MS

砂仁是姜科植物陽春砂（Amomum villosum Lour.）、綠殼砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen）或海南砂（Amomum longiligularg T.L.wu）的干燥成熟果實(shí)，為四大南藥之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，主要用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動(dòng)不安等病癥[1]，在治療消化系統(tǒng)等方面的疾病具有很獨(dú)特的功效[2]。隨著砂仁藥材的需要量逐年增加，砂仁的人工種植面積也在逐漸擴(kuò)大，藥材的農(nóng)藥濫用誤用現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生[3]。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是在有機(jī)磷類農(nóng)藥之后發(fā)展起來的一種合成農(nóng)藥，作為殺蟲劑、除草劑和殺菌劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，具有高效、低殘留的特點(diǎn)[4]。然而，在中藥材的害蟲防治過程中也易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，不僅會(huì)污染水體、土壤，破壞生態(tài)結(jié)構(gòu)，也會(huì)影響臨床用藥健康，對人類的健康產(chǎn)生危害[5]。筆者擬采用 QuEChERS 凈化工藝，優(yōu)化提取與凈化方法，旨在建立砂仁中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法，滿足砂仁中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的日常檢測要求。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?儀器設(shè)備。

TE412-L電子天平（德國賽多利斯公司）;XW-80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）;MS 3 basic 型振蕩器（德國 IKA 公司）;VS-24SMT高速大容量離心機(jī)（美國VISION公司）;Triple Quad 4500液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）。

1.1.2?試劑。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜級，美國Fisher公司）;氯化鈉、醋酸銨、無水硫酸鎂均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（C18）購于美國 Agilent 公司;超純水以美國Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備獲得;0.22 μm微孔濾膜購自安譜實(shí)驗(yàn)科技（上海）股份有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威、滅多威（1 000 μg/mL，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購自天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心）。

1.1.3?試材。

試驗(yàn)所用16批砂仁樣品來自于廣東、云南、廣西、海南的藥材基地和藥材市場，經(jīng)海南省樂東黎族自治縣熱作辦公室陳祥軍老師鑒定，均為姜科豆蔻屬植物砂仁的果實(shí)。樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過3號篩（藥典篩，50目），裝于密封袋中，置干燥器中保存、備用。

1.2?方法

1.2.1?樣品的前處理。

1.2.1.1?提取。準(zhǔn)確稱取5.00 g試樣，置于100 mL離心管中，加入4 g氯化鈉和2 g無水硫酸鈉，再加入20.0 mL乙腈（含1%甲酸），浸泡15 min，3 000 r/min渦旋振動(dòng)1 min，再以5 000 r/min離心5 min。

1.2.1.2?凈化。取上層溶液5.0 mL于預(yù)先加有1 000 mg MgSO4、200 mg PSA及200 mg C18的離心管中，渦旋混勻1 min，再以5 000 r/min離心5 min 。吸取上清液1.0 mL與1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合均勻，過0.22 μm微孔濾膜，經(jīng)UPLC-MS/MS上機(jī)分析。

1.2.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

1.2.2.1?標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取10種氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存。

1.2.2.2?混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0.1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18 ℃保存。

1.2.2.3?混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別精密吸取1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10 、0.20 、0.40 、1.00和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）定容，配制成0.005、0.010、0.020、0.040、0.100和0.200 μg/mL的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2.4?基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確稱取5.00 g空白砂仁樣品各5份，按“1.2.1”的方法進(jìn)行前處理試驗(yàn)，吸取上清液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按體積比1∶1混合均勻，配制成0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0和0.100 0 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3?儀器工作條件。

1.2.3.1?色譜條件。

色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm），1.7 μm ，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A為1.0 mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.5），流動(dòng)相B為甲醇，流速為0.25 μg/min。梯度洗脫程序，0～1.0 min，90% A;1.0～2.0 min，90%～30% A;2.5～4.0 min，30%A;4.0～5.0 min，30%～5% A;5.0～9.0 min，5% A;9.0～9.1 min，5%～90% A;9.1～10.0 min，90% A。流速0.25 μg/min。

1.2.3.2?質(zhì)譜條件。

離子源：ESI源，正離子模式;離子源溫度：550 ℃;毛細(xì)管電壓：5.5 kV;霧化氣壓力：344.7 kPa;去溶劑氣壓力：413.7 kPa;氣簾氣壓力：72.4 kPa;碰撞氣壓力：55.2 kPa;檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。MRM模式下10種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?UPLC-MS/MS分析參數(shù)的優(yōu)化

在ESI源正離子模式下，以10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的單標(biāo)溶液作為調(diào)試液進(jìn)行手動(dòng)調(diào)諧，優(yōu)化各化合物的母離子和子離子，每個(gè)化合物選取2組靈敏度較高的離子對作為定量離子和定性離子，并獲得最佳的錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，結(jié)果見表1。

取0.02 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS上機(jī)，獲得10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥成分的總離子流色譜圖（圖1）和MRM色譜圖（圖2），在10 min內(nèi)，可完成上述農(nóng)藥的分析，對應(yīng)的保留時(shí)間見表1。

2.2?方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1?線性關(guān)系考察。取“1.2.2.4”中的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工

作溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS分析，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在2.5～100.0 μg/L線性關(guān)系良好，R2≥0.999（表2）。稱取空白砂仁樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行樣品添加試驗(yàn)，按照“1.2.1”方法進(jìn)行前處理試驗(yàn)并上機(jī)，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算砂仁中10種農(nóng)藥的檢出限，各農(nóng)藥的方法檢出限在0.06～1.20 μg/kg（表2），根據(jù)10倍信噪比計(jì)算理論定量限在0.19～4.01 μg/kg。

2.2.2?精密度試驗(yàn)。

取“1.2.2.4”中的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2.3”儀器工作條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)。

取“1.2.2.4”中的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2.3”儀器工作條件，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為4.4%、2.7%、2.6%、7.7%、7.2%、4.7%、5.9%、2.2%、1.7%、7.1%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4?重復(fù)性試驗(yàn)。

稱取編號1的藥材6份，按照“1.2.1”提取方法，以0.40 mg/kg作為添加濃度，做加樣回收率試驗(yàn)，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5?加樣回收率試驗(yàn)。

選取0.02、0.08和0.40 mg/kg作為加樣回收試驗(yàn)的3個(gè)添加濃度，取編號1的藥材，按照“1.2.1”方法，計(jì)算10種農(nóng)藥回收率，每個(gè)水平平行測定3次，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表3。結(jié)果表明，10種農(nóng)藥殘留的平均回收率為70.7%～113.3%;RSD為0.2%～4.9%，均滿足定量分析要求。

2.3?樣品測定

按照“1.2.1”樣品前處理方法和“1.2.3”儀器分析條件，對采集的16批砂仁樣品進(jìn)行檢測，每份樣品平行測定2次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并未在樣品中檢測出10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。

3?結(jié)論與討論

3.1?提取方法的優(yōu)化

砂仁作為常用的芳香化濕類中藥，含有豐富的揮發(fā)性成分，如乙酰龍腦酯、樟腦、龍腦、月桂烯等，同時(shí)也含有多糖、脂肪酸、色素、鞣質(zhì)等成分[6]，對砂仁的農(nóng)藥殘留測定具有一定的干擾，不僅降低了儀器的靈敏度和準(zhǔn)確度，還增加了儀器的維護(hù)成本。因此，在對樣品檢測前，需要對樣品進(jìn)行一定的凈化處理。

QuEChERS是近年來應(yīng)用于食品檢測中十分普遍的一項(xiàng)前處理技術(shù)，具有快速、便捷、分析范圍廣、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)[7]。該試驗(yàn)采用1%甲酸的乙腈溶液提取砂仁樣品，再加入了PSA、C18作為吸附劑對提取液進(jìn)行凈化，以PSA吸附其中的有機(jī)酸、鞣質(zhì)等極性成分，以C18去除其中的一些非極性成分，可以得到顏色較淺、無色澄清的待測溶液。

3.2?基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是影響定量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一，會(huì)對目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定量造成較大影響。ME的評價(jià)方法常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比來進(jìn)行評估，當(dāng)ME值在80%～120%為無明顯基質(zhì)效應(yīng)，在80%以下為基質(zhì)抑制效應(yīng)，在120%以上為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[8]。

為提高分析方法的可靠性，試驗(yàn)對砂仁提取液的基質(zhì)效應(yīng)也進(jìn)行了考察。配制砂仁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行儀器分析，繪制校正曲線，計(jì)算兩者斜率之比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均小于80%，其中異丙威、3-羥基克百威和滅多威的斜率比分別為13.0%、19.4%、17.2%，說明均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)現(xiàn)象，因此，該試驗(yàn)采用砂仁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，10種農(nóng)藥在2.5～100.0 μg/L線性關(guān)系良好，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3個(gè)添加水平進(jìn)行回收試驗(yàn)，10種農(nóng)藥回收率在70.7%～113.3%。

3.3?色譜條件的選擇

目前測定食品中氨基甲酸酯的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法以及生物檢測法和生物傳感器法[9]。由于氨基甲酸酯類化合物極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差，目前以液相色譜-柱后衍生法和液相色譜-質(zhì)譜法較為普遍[10]。液相色譜-柱后衍生法需要經(jīng)柱分離后在線水解生成甲胺，再進(jìn)行熒光衍生，定性手段比較單一，抗干擾能力弱，對于砂仁中農(nóng)藥的檢測存在一定量的不足[11]。在中國藥典2015版中，也有部分氨基甲酸酯類農(nóng)藥采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。該研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測砂仁，方法簡便快捷、靈敏度高、基質(zhì)效應(yīng)小、準(zhǔn)確度高，適用于砂仁中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測。

3.4?樣品測定

砂仁在國內(nèi)的產(chǎn)地主要有廣東、廣西、云南、海南四省，隨著臨床使用量的擴(kuò)大，野生資源逐漸減少，開始轉(zhuǎn)為人工種植，其中以云南、廣東產(chǎn)量較高，尤以云南省栽培面積最廣[12]。但由于中藥種植的基礎(chǔ)設(shè)施較薄弱，規(guī)模化的中藥種植易受到病蟲害的影響，農(nóng)藥濫用亂用的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[13-14]。該研究采集的16批藥材中，經(jīng)檢測，并未有抗蚜威等10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出，通過回訪，推測其原因?yàn)檗r(nóng)戶一般在砂仁的苗期對葉片進(jìn)行農(nóng)藥噴施，果期施用較少。但建立砂仁中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，為砂仁中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的防控監(jiān)測提供了一項(xiàng)重要的技術(shù)手段，也可以為姜科同屬的其他作物和藥材的檢測提供技術(shù)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2015年版 一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：169.

[2]陸山紅，趙榮華，幺晨，等.砂仁的化學(xué)及藥理研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2016，32（1）：227-230.

[3]陳彩英，詹若挺，王小平.砂仁品種、種質(zhì)資源的考證溯源[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35（4）：354-357，376.

[4]崔偉偉，張強(qiáng)斌，朱先磊.農(nóng)藥殘留的危害及其暴露研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（2）：883-884，889.

[5]卜元卿，孔源，智勇，等.化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染及其防控對策建議[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2014，16（2）：19-25.

[6]魯藝，申麗，王洋，等.砂仁揮發(fā)油中7種活性成分的含量測定研究[J].藥物分析雜志，2016，36（9）：1536-1543.

[7]劉亞偉，董一威，孫寶利，等.QuEChERS在食品中農(nóng)藥多殘留檢測的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（9）：285-289.

[8]蘇萌，艾連峰.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)及其消除方法[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5（2）：511-515.

[9]譚彥，蔣屏，陳傳品.食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測方法的研究進(jìn)展[J].科技風(fēng)，2019（15）：221.

[10]黃志強(qiáng).食品中農(nóng)藥殘留檢測指南[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[11]張艷俠，張婷，薛霞，等.QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中17種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留[J].分析試驗(yàn)室，2019，38（1）：13-18.

[12]張麗霞，彭建明，馬潔，等.砂仁種質(zhì)資源研究概況[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：788-789.

[13]張丹雁，劉軍民，徐鴻華.陽春砂的病蟲害調(diào)查與防治[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19（4）：15-17.

[14]陳建設(shè)，李海濤，唐德英，等.云南陽春砂產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17（7）：690-693，703.