馮翠萍，劉一諾，樊雙喜，武竹英，鐘其頂,3,*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100015；3.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100015）

核磁共振磷譜（31P nuclear magnetic resonance，31P NMR）從1985年就開始應(yīng)用于食品領(lǐng)域，現(xiàn)已在食品中有廣泛的應(yīng)用[1-8]。31P NMR靈敏度約為氫譜的6.64%，是碳譜的377 倍，化學(xué)位移范圍很寬，且無四極矩效應(yīng)，因此有很好的靈敏度和分辨率，用于定量分析有較大的優(yōu)勢。酪蛋白是乳品中主要的蛋白組分，主要包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，都是含磷的蛋白質(zhì)[9-10]，所以可用31P NMR進(jìn)行檢測。

酪蛋白進(jìn)入機(jī)體后在胰蛋白酶等作用下，水解成酪蛋白磷酸肽，研究表明酪蛋白磷酸肽具有促進(jìn)小腸對礦物質(zhì)尤其是鈣的吸收，促進(jìn)牙齒、骨骼中鈣的沉淀和鈣化及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[10-13]。酪蛋白是牛奶及其他乳制品中最主要的蛋白質(zhì)，牛奶中的酪蛋白約占蛋白總量的80%～90%。酪蛋白含量是衡量牛奶及其他乳制品營養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。部分乳制品生產(chǎn)廠家為降低成本，用明膠、乳清粉、大豆分離蛋白等代替乳蛋白，因此僅測定總蛋白質(zhì)含量，不能檢出是否摻假。酪蛋白作為牛乳中的一種特征蛋白質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2.6%，很少受到季節(jié)、飼料等因素的影響。所以檢測酪蛋白的含量可作為判定乳制品中經(jīng)濟(jì)摻假行為的重要指標(biāo)[14]，因此，亟需建立一種快速且準(zhǔn)確性高的定量檢測乳制品中酪蛋白的方法。

目前我國GB 31638ü 2016《酪蛋白》中已提出酪蛋白的指標(biāo)，并在附錄A中指定了測定方法，即常規(guī)測定乳制品中酪蛋白的方法[15-17]，先用等電沉淀法提取乳制品中的酪蛋白，再用GB 5009.5ü 2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法或第二法測定。提取酪蛋白的過程步驟較多，用時(shí)較長，不確定的因素多，所以誤差較大。蛋白質(zhì)的測定方法中第一法或第二法也各有其缺點(diǎn)，第一法凱氏定氮法，靈敏度低，用時(shí)長（8～10 h），含氮的其他物質(zhì)對測定會造成干擾，如三聚氰胺事件。第二法分光光度法，嘌吟和嘧啶及各種核苷酸對檢測會造成干擾，干擾物質(zhì)多，準(zhǔn)確度也較差。對于高溫消毒的牛奶，因加熱的過程中乳清蛋白可能和酪蛋白產(chǎn)生共價(jià)鍵連接，用常規(guī)方法會造成測定結(jié)果偏大。有相關(guān)研究報(bào)道采用納米材料BSPOTPE測定奶粉中酪蛋白的含量[18]，這種方法依賴于BSPOTPE納米材料，且樣品中和酪蛋白分子大小相似的物質(zhì)，如脂肪會對測定造成干擾。也有報(bào)道用同位素稀釋質(zhì)譜法測嬰幼兒配方奶粉及牛乳、乳粉為原料的飲料中酪蛋白的含量[19-20]，但仍需用等電沉淀法提取酪蛋白，再加入多肽同位素內(nèi)標(biāo)和胰蛋白酶進(jìn)行酶解16 h，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定量分析，檢測所需時(shí)間長，步驟繁瑣。酶聯(lián)免疫法[21]同樣需要首先提取酪蛋白，再依賴特異性的抗體實(shí)現(xiàn)檢測，且屬于半定量的檢測方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[22]需要獲取相關(guān)的基因片段、昂貴的設(shè)備和專業(yè)人才，應(yīng)用有一定的限制；毛細(xì)管電泳法[23]準(zhǔn)確性不夠高，也不能廣泛應(yīng)用于各類乳品的檢測。所以還沒有一種簡單快速且準(zhǔn)確性高的定量檢測乳制品中酪蛋白的方法。

基于以上問題將31P NMR用于測定乳制品中酪蛋白的含量，旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的酪蛋白定量檢測方法。相比于現(xiàn)有酪蛋白測定方法，前處理簡單快速，高溫滅菌等處理也不會對測定結(jié)果造成影響，測定的干擾因素少，準(zhǔn)確性高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（C5890） 美國Sigma-Aldrich公司；亞甲二膦酸（≥98%） Aladdin試劑（上海）有限公司；二水合乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，≥99%）、疊氮化鈉（高純）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；重水（D2O，99.9%）青島騰龍微波科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）北京化工廠；水為GB/T 6682ü 2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級水；不同品牌的各類乳制品購于北京某大型超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Avance III HD 400M波譜儀（配備BBO探頭、SampleJet自動進(jìn)樣器、SampleJet 5 mm高通量核磁管、pH計(jì)） 德國Bruker Biospin公司；MX-S渦旋混合器大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EDTA溶液配制

準(zhǔn)確稱取1.86 g EDTA溶于8 mL水中，在渦旋混合器上充分混合，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，使EDTA充分溶解于水中，再加入1 mg疊氮化鈉，充分搖勻，然后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，用D2O定容至10 mL。

1.3.2 亞甲二磷酸溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.352 g亞甲二磷酸，用渦旋混合器充分溶解于8 mL水中，完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至10 mL。

1.3.3 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

準(zhǔn)確稱取5.00 mg酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，溶于800 μL去離子水中，再加入10 μL 200 mmol/L的亞甲二磷酸、100 μL 0.5 mol/L EDTA，充分搖勻，用1 mol/L的NaOH-D2O溶液調(diào)pH值為9.5，再用氘水稀釋至1 mL，得到質(zhì)量濃度為5.00 g/L的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，取600 μL于核磁管中測定；用同樣的方法配制10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00 g/L的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并分別取600 μL于核磁管中測定。

1.3.4 樣品的制備

1.3.4.1 液體奶樣品制備

準(zhǔn)確吸取800 μL液體奶，加入10 μL 200 mmol/L的亞甲二磷酸溶液，100 μL 0.5 mol/L EDTA，充分搖勻。再用1 mol/L的NaOH-D2O溶液調(diào)pH值為9.5，再用氘水稀釋至1 mL。8 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上層脂肪，取600 μL于核磁管中測定。對于高鈣液體奶，先用水稀釋，再配制，稀釋的比例為液體奶和水的體積比為3∶1。

1.3.4.2 奶粉樣品制備

稱取200 mg奶粉樣品溶于1 mL水中，充分搖勻。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.4.3 酸奶樣品制備

準(zhǔn)確稱取5 g酸奶，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為9.5，然后準(zhǔn)確稱量調(diào)完pH值的酸奶質(zhì)量。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.4.4 奶片樣品制備

將奶片研磨成粉末，稱取200 mg奶片粉末樣品溶于1 mL水中，充分搖勻。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.531P NMR上機(jī)測試參數(shù)

采用BBO探頭，31P的共振頻率為161.97 MHz，Bruker Top Spin 3.5軟件用于31P NMR譜圖數(shù)據(jù)的采集；掃描次數(shù)1 700；譜寬5 000 Hz；中心頻率106；弛豫延遲時(shí)間2 s；采樣時(shí)間1.6 s；檢測溫度300 K；布魯克的標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列zgig30；檢測核為31P。

1.3.6 精密度分析

選取一個(gè)樣品溶液，同一天內(nèi)連續(xù)測定5 次，取平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，每天測定5 次取平均值，分析方法的日間精密度。

1.3.7 回收率實(shí)驗(yàn)

配制樣品20 份，其中5 份作為對照組，其余15 份由低至高，分別添加5.00、10.00、15.00 g/L 3 個(gè)不同質(zhì)量濃度水平的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，在1.3.5節(jié)的條件下測定其31P NMR，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 方法對比

將31P NMR定量檢測乳品中酪蛋白的方法與食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31638ü 2016附錄A中指定的酪蛋白測定方法用于檢測同一批樣品，對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，驗(yàn)證檢測方法的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MestReNova 12.0軟件（Mestrelab Research S.L.，MestReNova（Mnova）NMR，USA）對31P NMR譜圖進(jìn)行傅里葉變換、基線矯正、相位調(diào)整。線寬因子為3。相位校正選擇metabonomics算法，先自動優(yōu)化，后針對特定區(qū)域進(jìn)行手動校正，使盡可能多的積分值為正值?；€校正選擇polynomial fit擬合方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳制品中酪蛋白含量31P NMR譜定量方法選擇

在乳制品中磷以多種形式存在，包括在乳清蛋白和酪蛋白膠束中和鈣結(jié)合的無機(jī)磷，以及與酪蛋白、脂類和碳水化合物等分子以共價(jià)結(jié)合的有機(jī)磷。在31P NMR中，乳制品中和酪蛋白以共價(jià)鍵結(jié)合的磷酸酯和其他形式存在的磷能夠很好地分離[24-25]。向乳制品中加入EDTA消除鈣離子干擾的前提下，將樣品的pH值調(diào)至堿性，不同的酪蛋白可在同一個(gè)位置出峰，為定量提供了便利[24,26]。

由于乳制品中的酪蛋白是混合物，不能用常規(guī)的內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量，所以采用酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用插值法得到牛奶中酪蛋白含量，具體步驟如下：首先測定加入固定量內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的磷譜，將酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)積分面積比值作橫坐標(biāo)，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度作縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=ɑx+β，再用相同條件測定用相同方法制備的乳制品樣品的磷譜，得到樣品中酪蛋白和二甲基磷酸積分面積比值，用插值法得到乳制品樣品中酪蛋白的含量。

也可以選擇不用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，將酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品積分面積的絕對值作橫坐標(biāo)，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度作縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=ɑx+β，再用相同方法得到樣品中酪蛋白的絕對積分面積，用差值法得到樣品中酪蛋白的含量。如果不用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對于內(nèi)標(biāo)物和樣品測試參數(shù)和處理參數(shù)必須完全一致，如線寬因子、傅里葉變換點(diǎn)數(shù)、基線矯正方法、積分方法、積分范圍等。為降低測試及譜圖處理等因素對結(jié)果造成影響，選擇使用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的方法。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品選擇

牛乳制品中酪蛋白含量會隨著季節(jié)等因素有較小幅度的改變，但酪蛋白中磷含量穩(wěn)定[17]。不同種類乳制品，酪蛋白中磷含量會有差別[27]，如測定羊乳制品中的酪蛋白含量，應(yīng)選用相對應(yīng)的酪蛋白標(biāo)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，否則會對定量結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。

2.3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)、定量峰、積分區(qū)域選擇

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)滿足一般核磁定量測試對內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的要求，即內(nèi)標(biāo)物質(zhì)不與待測樣品反應(yīng)，能溶于待測樣品，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信號不和待測樣品中信號重疊，且內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信號峰和待測物質(zhì)定量信號峰位移相差不應(yīng)太大。亞甲二磷酸可溶于牛奶，其磷譜信號不和牛奶中各種磷信號重疊，且和酪蛋白的位移值相差較小，因此選用亞甲二磷酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

由圖1可知，當(dāng)內(nèi)標(biāo)亞甲二磷酸信號位移定為δ16.13時(shí)，δ3.89處的多峰為酪蛋白定量峰，亞甲二磷酸積分區(qū)域?yàn)棣?6.75～15.60，酪蛋白積分區(qū)域?yàn)棣?.41～3.45。

圖1 乳制品樣品的31P NMR譜圖Fig.1 31P NMR spectrum of dairy sample

2.4 檢測參數(shù)優(yōu)化

按照常規(guī)的核磁定量方法，為保證定量準(zhǔn)確，弛豫延遲時(shí)間應(yīng)大于5 倍的縱向弛豫時(shí)間，使得信號得到完全弛豫。根據(jù)文獻(xiàn)[28]可知，與酪蛋白結(jié)合的磷酸酯的31P NMR縱向弛豫時(shí)間為2 s，亞甲二磷酸31P NMR的縱向弛豫時(shí)間為6 s，所以弛豫延遲時(shí)間至少應(yīng)為30 s，樣品檢測時(shí)間太長。采用先作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用插值法得到樣品中酪蛋白含量時(shí)，不需要保證測試過程中磷的信號完全弛豫，只需保證相同的測試時(shí)間，定量信號有較高的信噪比（RSN），標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性。

測試時(shí)間均為1.7 h，弛豫延遲時(shí)間在0.5～16 s分別測試得到譜圖（圖2）。弛豫延遲時(shí)間從0.5 s降至2 s，RSN相差較小，弛豫延遲時(shí)間不小于4 s時(shí)，RSN逐漸降低。按照1.3.3節(jié)的方法配制酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，弛豫延遲時(shí)間分別為0.5 、1 、2 s，采樣次數(shù)分別為2 900、2 350、1 700，使得測試時(shí)間均為1.7 h，1.3.5節(jié)中其他測試參數(shù)不變測試得到譜圖，以酪蛋白定量峰的積分面積和內(nèi)標(biāo)物定量峰的積分面積比值作橫坐標(biāo)，酪蛋白的濃度作縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.958 8、0.960 0、0.999 6，可見弛豫延遲時(shí)間為2 s時(shí)有較好的RSN和線性，所以本實(shí)驗(yàn)采用弛豫延遲時(shí)間為2 s，采樣次數(shù)為1 700。

圖2 相同測試時(shí)間時(shí)不同弛豫時(shí)間得到的酪蛋白NMR譜圖Fig.2 NMR spectra of casein obtained with different relaxation times at the same test time

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

2.5.1 線性關(guān)系

以酪蛋白積分面積和內(nèi)標(biāo)物積分面積比值作橫坐標(biāo)，酪蛋白質(zhì)量濃度作縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=18.439x+0.069，R2=0.999 6，可見線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度分析

用同奶粉樣品相同的方法對液體奶、酸奶、奶片樣品進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度分析。如表1所示，奶粉樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.65%和1.40%；液體奶樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為0.87%和1.62%；酸奶樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為0.90%和1.75%；奶片的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為1.4%和1.80%。日內(nèi)與日間兩者酪蛋白測定結(jié)果均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 1 Precisions of the method (n= 5)

2.5.3 回收率實(shí)驗(yàn)

將液體奶和酸奶用水稀釋1 倍，奶片研磨成粉末，均用與奶粉樣品相同的方法做回收率實(shí)驗(yàn)。如表2所示，該方法的回收率在91.94%～105.10%范圍區(qū)間，回收率的RSD在0.87%～1.50%范圍區(qū)間，可見奶粉、液體奶、酸奶、奶片中酪蛋白檢測方法精確度較好，能夠滿足酪蛋白含量準(zhǔn)確測定要求。

表2 方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Recovery of spiked samples (n= 5)

2.5.4 檢出限與定量限

將酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品譜圖RSN為3時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢出限，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)譜圖RSN為10時(shí)的質(zhì)量濃度作為定量限[19,29]。在1.3.5節(jié)及1.3.6節(jié)的測試參數(shù)及數(shù)據(jù)處理?xiàng)l件下，檢測限為0.38 g/L，定量限為1.25 g/L。

2.5.5 方法準(zhǔn)確性分析

將以上建立的31P NMR定量檢測乳制品中酪蛋白的方法和GB 31638ü 2016附錄A中指定的酪蛋白測定方法分別用于檢測同一批11 個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測定2 次，取平均值，對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，結(jié)果如表3所示，其中編號為8和9的樣品為酸奶樣品，樣品本身的pH值低于酪蛋白的等電點(diǎn)，不適用于國標(biāo)法測定。以國標(biāo)法測定結(jié)果為橫坐標(biāo)，以31P NMR定量結(jié)果為縱坐標(biāo)作線性回歸，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，國標(biāo)法和31P NMR定量結(jié)果誤差在±5%以內(nèi)，滿足方法可行性對比分析驗(yàn)證要求。研究表明31P NMR定量法可以用于對乳品中酪蛋白的準(zhǔn)確測定，且更具有廣泛的適用性。

表3 31P NMR定量法與國標(biāo)法測定乳制品中酪蛋白含量比較Table 3 Comparison of casein contents in dairy products determined by the 31P NMR method and the national standard method

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種采用31P NMR技術(shù)對乳制品中酪蛋白定量的方法，對于現(xiàn)有測試條件該方法的檢出限為0.38 g/L（RSN=3），定量限為1.25 g/L（RSN=10），具有較高的靈敏度，完全滿足一般乳品中酪蛋白的檢測需求。在5.00～35.00 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999；加標(biāo)回收率在91.94%～105.10%范圍區(qū)間；日內(nèi)精密度在0.65%～1.40%范圍區(qū)間；日間精密度在1.40%～1.80%范圍區(qū)間。31P NMR與GB 31638ü 2016測定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi)，測定結(jié)果準(zhǔn)確。該方法相比GB 31638ü 2016方法，樣品用量少，前處理操作簡便，對于市售的一般奶粉和液體奶樣品檢測單個(gè)樣品的時(shí)間為1.7 h左右，如果儀器靈敏度提高或用容積大的10 mm核磁樣品管，檢測時(shí)間可以更短。在確保重復(fù)性、測定結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，該方法極大的節(jié)約了時(shí)間與人力，大批量樣品檢測時(shí)成本較低，同時(shí)適用于對pH值低于酪蛋白等電點(diǎn)的酸奶樣品中酪蛋白的檢測，可廣泛應(yīng)用于相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)以及企業(yè)日常檢驗(yàn)、生產(chǎn)指導(dǎo)、出廠檢驗(yàn)等方面。