許小炫，蘇曉娜，譚 庶，鐘翠麗，曾道平，張 燕，徐振林，王 序，楊金易,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527400；3.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 佛山 528300）

金剛烷胺（amantadine，AMA）是用于治療流感疾病的抗病毒藥物，農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告規(guī)定禁止AMA類藥物在養(yǎng)殖業(yè)的使用，然而2012年“速生雞”事件反映了養(yǎng)禽業(yè)仍存在AMA濫用的問(wèn)題[1]。研究表明，動(dòng)物飼養(yǎng)中AMA的濫用問(wèn)題增強(qiáng)了流感病毒的耐藥性，而且對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性等毒副作用[2-4]。氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已將CAP從2000年版《中國(guó)獸藥典》刪除并列為禁藥，但自“CAP風(fēng)波”以來(lái)，CAP的濫用問(wèn)題層出不窮[5]。CAP殘留不僅會(huì)使大部分細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，還可能導(dǎo)致骨髓造血機(jī)能絮亂、粒細(xì)胞/血小板減少、再生障礙性貧血等毒副作用[6]。目前實(shí)施的動(dòng)物性食品中AMA殘留量測(cè)定方法的檢測(cè)限為1 μg/kg，2004年歐盟委員會(huì)已將CAP的檢測(cè)底限降低為0.1 μg/kg[7]。

當(dāng)前報(bào)道的檢測(cè)禽肉樣品中AMA和CAP殘留的方法主要有儀器分析法[8-9]、微生物測(cè)定法[10-11]、免疫分析法[12-13]。儀器分析法主要包括高效液相色譜法[14-15]和氣相色譜法[16-17]，準(zhǔn)確性高，但有操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)人員素質(zhì)要求高、難以滿足快速檢測(cè)等問(wèn)題。近年來(lái)報(bào)道的免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附法[18-19]、化學(xué)發(fā)光免疫[20-21]、免疫傳感器[22]、膠體金試紙條[23-24]、免疫磁珠[25]、免疫芯片[26]等。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法（chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLEIA）是根據(jù)酶聯(lián)免疫分析的基本原理，將高特異性的免疫反應(yīng)和高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合以檢測(cè)抗原或者抗體的免疫技術(shù)。目前已有使用CLEIA方法檢測(cè)動(dòng)物組織中的AMA和CAP的文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，然而，這些方法的不足之處在于檢測(cè)目標(biāo)過(guò)于單一，均為獨(dú)立的前處理過(guò)程，無(wú)法實(shí)現(xiàn)同時(shí)處理和分析，不可避免地帶來(lái)檢測(cè)效率低下、成本高、浪費(fèi)時(shí)間等問(wèn)題，更無(wú)法滿足愈來(lái)愈繁重的突發(fā)事件和應(yīng)急監(jiān)控工作的需要。目前適用于AMA和CAP殘留同步檢測(cè)的免疫分析方法及前處理方法鮮見報(bào)道，因此有必要開發(fā)出一種能同時(shí)提取禽肉樣品中AMA和CAP兩類藥物總量的樣品處理技術(shù)以及相應(yīng)的CLEIA檢測(cè)方法。

目前已報(bào)道的提取AMA和CAP的有機(jī)溶劑多為乙腈、酸性乙腈、乙酸乙酯和堿性乙酸乙酯[27-28]。AMA在結(jié)構(gòu)上屬于有機(jī)堿，在酸性溶液中易溶于水，在堿性溶液中易溶于有機(jī)溶劑。通過(guò)儀器驗(yàn)證證實(shí)，AMA和CAP在堿性環(huán)境中能被有機(jī)溶劑更好地萃取[29-30]。針對(duì)AMA和CAP的化學(xué)特征，本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期所得的AMA抗體及抗原、CAP抗體及抗原建立了間接競(jìng)爭(zhēng)性CLEIA（ic-CLEIA）檢測(cè)方法，并創(chuàng)新性地使用碳酸鉀和乙酸乙酯提取藥物的方法將AMA和CAP的樣品前處理方法合并，對(duì)ic-CLEIA方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，適用于實(shí)際樣品中AMA和CAP藥物的同步檢測(cè)。本方法旨在使檢測(cè)結(jié)果不僅靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，而且操作方便、節(jié)約時(shí)間，可以滿足禽肉AMA和CAP藥物兩種藥物的實(shí)際檢測(cè)需求，為后期實(shí)現(xiàn)快速聯(lián)檢禽肉樣品中多種違禁藥物殘留檢測(cè)方法提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未含AMA及CAP雞肉、鴨肉、鴿肉 市購(gòu)。

AMA多克隆抗體（anti-AMA pAb，2.33 mg/mL）、AMA包被原（AMA-BSA，7.43 mg/mL）、CAP單克隆抗體（anti-CAP mAb，3.5 mg/mL）、CAP包被原（CAP-BSA，18 mg/mL）由廣東省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存[31-32]；AMA、CAP、金剛乙胺、氟苯尼考 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海分公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（1 mg/mL）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1 mg/mL） 安諾倫生物科技有限公司；96 孔不透明白色發(fā)光板 深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液 GE Healthcare中國(guó)公司；所用溶劑和試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

JZ-II型均質(zhì)器 莆田市南榮貿(mào)易有限公司；超低溫高速離心機(jī) 美國(guó)E p p e n n d o r f 公司；WallacVICTOR31420多功能標(biāo)記分析儀 美國(guó)PE公司；氮吹儀 康寧科技有限公司；QP50質(zhì)譜儀 日本島津公司；1200系列液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；ZHJH-1122超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械公司。

1.3 方法

1.3.1 ic-CLEIA的操作步驟

包被：用包被液將包被原稀釋至相應(yīng)的最適濃度，包被96 孔不透明白色發(fā)光板，每孔150 μL，4 ℃條件下16 h包被。封閉：經(jīng)每孔300 μL洗液洗滌2 次后，每孔加入170 μL封閉液，37 ℃封閉4 h，甩干孔中的液體，置于37 ℃烘箱中2 h備用。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液（50 μL/孔），先加入50 μL酶標(biāo)二抗，再加入50 μL抗體工作液，混勻后25 ℃反應(yīng)一定時(shí)間，洗滌4 次，每孔加入100 μL底物緩沖液和底物液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，2 min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每孔的發(fā)光值RLU。

1.3.2 ic-CLEIA方法的優(yōu)化

1.3.2.1 包被原及單克隆抗體的稀釋倍數(shù)組合

取96 孔化學(xué)發(fā)光板，用包被液將包被原作一系列稀釋，稀釋倍數(shù)為2 500、5 000、10 000、20 000、30 000、40 000 倍；AMA多克隆抗體按5 000、10 000、15 000、20 000、40 000 倍稀釋，而CAP單克隆抗體按20 000、40 000、80 000、120 000、160 000 倍稀釋，按照1.3.1節(jié)的步驟操作，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的RLUmax、IC50和RLUmax/IC50，以RLUmax/IC50較高、IC50較低、RLUmax適中時(shí)的條件為CLEIA的最佳反應(yīng)條件。

1.3.2.2 二抗稀釋倍數(shù)和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間優(yōu)化

AMA的羊抗兔酶標(biāo)二抗按2 000、4 000、6 000、8 000 倍和10 000 倍稀釋，CAP的羊抗鼠酶標(biāo)二抗按6 000、8 000、10 000、20 000 倍和30 000 倍稀釋，以20、25、30 min和40 min競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間反應(yīng)，按照1.3.1節(jié)的步驟操作，以RLUmax/IC50較高、IC50較低、RLUmax適中時(shí)的條件為CLEIA的最佳反應(yīng)條件。

1.3.3 樣品前處理

稱取空白禽肉樣品2 g置于50 mL離心管中，加入6 mL乙酸乙酯和1 mL去離子水，渦旋振蕩3 min，加入2 mL碳酸鉀溶液，渦旋振蕩60 s，4 000 r/min離心5 min，取3 mL上清液于離心管中，于65 ℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑尤? mL正己烷和1 mL PB溶液，渦旋振蕩1 min，4 000 r/min離心1 min，棄去上層正己烷層，取下層溶液進(jìn)行ic-CLEIA分析（稀釋倍數(shù)為1）。

1.3.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

向空白樣品中添加AMA和CAP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其AMA的含量為0.5、1 μg/kg和2 μg/kg，CAP含量為0.05、0.1 μg/kg和0.2 μg/kg，經(jīng)前處理后用同一批次化學(xué)發(fā)光板對(duì)同批樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)4 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異；用不同批次化學(xué)發(fā)光板對(duì)同批樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)4 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批間變異。

1.3.5 儀器方法驗(yàn)證

禽肉中AMA殘留的儀器方法測(cè)定參照DB 21/2394ü 2014《雞肝和雞肉中AMA、金剛乙胺的檢測(cè) 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行，檢測(cè)限為0.5 μg/kg。禽肉中CAP殘留的儀器方法測(cè)定參照GB/T 22338ü 2008《動(dòng)物源性食品中CAP類藥物殘留量測(cè)定》進(jìn)行，檢測(cè)限為0.1 μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以AMA標(biāo)準(zhǔn)品濃度或CAP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），以發(fā)光值RLU為縱坐標(biāo)（Y），應(yīng)用Origin 8.5軟件中的四參數(shù)擬合競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品RLU值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。使用Origin 8.5軟件繪制相關(guān)ic-CLEIA圖表。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SAS 6.12軟件計(jì)算完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLEIA最優(yōu)條件的優(yōu)化

2.1.1 包被原、抗體最適工作濃度的確定

本研究以RLUmax、IC50和RLUmax/IC50作為評(píng)價(jià)各影響因素的標(biāo)準(zhǔn)，IC50越小，方法的靈敏度更高，RLUmax和RLUmax/IC50的高低決定曲線的線性可用范圍寬窄。由圖1、2可看出，當(dāng)包被原稀釋倍數(shù)為10 000，抗體稀釋倍數(shù)為15 000時(shí)，AMA-CLEIA的IC50較低，RLUmax/IC50較高，因此AMA-CLEIA的包被原和抗體的最適工作質(zhì)量濃度為743 μg/L和155 μg/L。同理，CAP-CLEIA的包被原和抗體的最適工作質(zhì)量濃度為3.6 mg/L（稀釋倍數(shù)5 000）和43.8 μg/L（稀釋倍數(shù)80 000）。

圖1 AMA（a）和CAP（b）包被原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig.1 Optimization of dilution factor of AMA-BSA (a) and CAP-BSA (b)

圖2 AMA（a）和CAP（b）抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig.2 Optimization of dilution factor of anti-AMA (a) and anti-CAP (b) antibody

2.1.2 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間和酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定

圖3 AMA（a）和CAP（b）競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of competition time for AMA (a) and CAP (b)

圖4 AMA（a）和CAP（b）酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig.4 Optimization of dilution factor of RP-labeled secondary antibody against AMA (a) and CAP (b)

抗原抗體能否充分結(jié)合與其反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，所以要對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖3 所示，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為30 min時(shí)，IC50最小，RLUmax/IC50較大，因此AMA-CLEIA和CAP-CLEIA的最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30 min。如圖4可知，AMA-CLEIA和CAP-CLEIA的最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為4 000和10 000。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖5 ic-CLEIA檢測(cè)AMA（a）和CAP（b）的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve for indirect competitive chemiluminescence enzyme linked immunoassay (ic-CLEIA) analysis of AMA (a) and CAP (b)

按照上述CLEIA條件優(yōu)化結(jié)果，以AMA或CAP標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。AMA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.06～1.77 μg/L，IC50為0.33 μg/L，檢出限為0.0 6 μ g/L。C A P 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.010～0.179 μg/L，IC50為0.039 μg/L，檢出限為0.009 μg/L。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取助劑種類和濃度的確定

研究去離子水、氨水、碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液和碳酸鉀溶液5 種提取助劑的提取效果，結(jié)果如圖6所示，根據(jù)回收率進(jìn)行比較，提取AMA效果最好的是碳酸鉀溶液，其次是氨水和碳酸鈉溶液，去離子水和氫氧化鈉溶液的提取效果較差。5 種提取助劑提取CAP差異性并不顯著，都能取得良好的回收率。最終選擇碳酸鉀溶液為AMA和CAP的提取助劑。比較了不同濃度的碳酸鉀的提取效率，由圖7可知，當(dāng)碳酸鉀濃度為1.2 mol/L時(shí)，AMA和CAP的添加回收率達(dá)到最高，因此確定碳酸鉀的最佳濃度為1.2 mol/L。

圖6 不同提取助劑的AMA和CAP添加回收結(jié)果Fig.6 Effect of extraction solvents on the recovery of AMA and CAP

圖7 不同濃度碳酸鉀的AMA和CAP添加回收結(jié)果Fig.7 Evaluation of the concentration of potassium carbonate on the recoveries of AMA and CAP

2.2.2 提取時(shí)間的優(yōu)化

圖8 不同振蕩時(shí)間的AMA和CAP添加回收結(jié)果Fig.8 Effect of shaking time on the recoveries of AMA and CAP

本研究的前處理方法中，加入純水和乙酸乙酯后，比較不同振蕩時(shí)間的提取效率，結(jié)果如圖8所示。振蕩時(shí)間越長(zhǎng)，AMA和CAP的回收率越高，當(dāng)振蕩時(shí)間為4 min時(shí)，2 種藥物的回收率與振蕩時(shí)間3 min無(wú)顯著差異。因此振蕩時(shí)間確定為3 min。加入碳酸鉀溶液后，比較不同萃取時(shí)間的提取效率，結(jié)果如圖9所示，60 s已經(jīng)將樣品中的CAP和AMA幾乎完全提取出，從節(jié)約時(shí)間和效率方面考慮，最終確定萃取時(shí)間為60 s。

圖9 不同萃取時(shí)間的AMA和CAP添加回收結(jié)果Fig.9 Effect of extraction time on the recoveries of AMA and CAP

2.2.3 樣品復(fù)溶液的優(yōu)化

由于藥物性質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)的作用，不同緩沖體系和離子強(qiáng)度的復(fù)溶液會(huì)影響藥物的實(shí)際樣品添加回收率。本實(shí)驗(yàn)選擇PB緩沖液作為樣品復(fù)溶液，并比較不同濃度的PB緩沖液下AMA和CAP的回收率，結(jié)果如圖10所示，隨著PB緩沖液的濃度增大，AMA的回收率先增大后趨于平穩(wěn)，CAP的回收率則越來(lái)越高，當(dāng)緩沖液濃度超過(guò)0.05 mol/L時(shí)，CAP的回收率超過(guò)120%。因此，確定PB緩沖液的最佳濃度為0.05 mol/L。

圖10 不同濃度PB緩沖液的AMA和CAP添加回收結(jié)果Fig.10 Effect of PB buffer concentration on the recoveries of AMA and CAP

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CLEIA方法的精密度以批內(nèi)變異和批間變異表示。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度做6 次重復(fù)，測(cè)得質(zhì)量濃度的變異系數(shù)表示批內(nèi)變異；取不同批次包被的化學(xué)發(fā)光板，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50和RLUmax值，連續(xù)進(jìn)行6 d測(cè)定，以IC50和RLUmax值的變異系數(shù)表示批間變異。結(jié)果如表1～3所示，批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間變異均小于5.6%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

表1 AMA批內(nèi)變異（n=6）Table 1 Intra-assay coefficients of variation of the CLEIA method for AMA (n= 6)

表2 CAP批內(nèi)變異（n= 6）Table 2 Intra-assay coefficients of variation of the CLEIA method for CAP (n= 6)

表3 AMA和CAP的批間變異（n=6）Table 3 Inter-assay coefficients of variation of the CLEIA method for AMA and CAP (n= 6)

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 AMA和CAP結(jié)構(gòu)類似物藥物交叉反應(yīng)率Table 4 Cross-reactivityof anti-AMA pAb and anti-CAP pAb determined by ic-CLEIA

由表4所示，除與金剛乙胺存在24.32%的交叉反應(yīng)率外，AMA與其他結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。CAP與其他結(jié)構(gòu)功能類似物均不存在明顯交叉反應(yīng)。表明CLEIA方法特異性良好，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性，錯(cuò)檢等現(xiàn)象。

2.5 空白樣品添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取高中低3 個(gè)添加量水平進(jìn)行樣品添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。其中所測(cè)樣品中AMA的平均添加回收率在92.55%～105.14%之間，CAP平均添加回收率在92.00%～112.50%之間，且兩者批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于10.48%。方法準(zhǔn)確度能達(dá)到檢測(cè)要求，適用于禽肉樣品中AMA和CAP的檢測(cè)。

表5 AMA和CAP的實(shí)際樣品添加回收率和變異系數(shù)（n=4）Table 5 Recoveries and coefficients of variation (CVs) of AMA and CAP spiked into poultry muscles (n= 4)

2.6 儀器方法對(duì)比

圖11 AMA（a）和CAP（b）ic-CLEIA與LC-MS方法對(duì)比Fig.11 Good linear correlation between ic-CLEIA and LC-MS values for AMA (a) and CAP (b)

隨機(jī)購(gòu)買100 份家禽樣品，其中雞肉60 份、鴨肉30 份、鴿肉10 份，均質(zhì)化后放入-20 ℃保存。按照建立的ic-CLEIA方法檢測(cè)所有樣品中的AMA和CAP，以DB 21/2394ü 2014的檢測(cè)限（0.5 μg/kg）作為AMA陰陽(yáng)性判定值，其中檢出8 份樣品為AMA陽(yáng)性，92 份樣品為AMA陰性；以GB/T 22338ü 2008的檢測(cè)限（0.1 μg/kg）作為CAP陰陽(yáng)性判定值，其中檢出5 份樣品為CAP陽(yáng)性，95 份樣品為CAP陰性，將可疑樣品和9 份陰性樣品分別再用ic-CLEIA方法和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）方法檢測(cè)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較測(cè)定結(jié)果。以HPLC-MS所測(cè)得的AMA或CAP的濃度為Y軸，以ic-CLEIA測(cè)得的AMA或CAP的濃度為X軸，繪制散點(diǎn)圖。如圖11所示，AMA的回歸方程為Y=1.18X-0.06，R2=0.988 1；CAP的回歸方程為Y=1.278X-0.005，R2=0.989 7。說(shuō)明建立的AMA和CAP的ic-CLEIA方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本研究建立了檢測(cè)禽肉中AMA和CAP殘留的ic-CLEIA檢測(cè)方法，AMA ic-CLEIA方法線性范圍為0.06～1.77 μg/L，IC50為0.33 μg/L，檢出限為0.06 μg/L；CAP ic-CLEIA方法線性范圍為0.010～0.179 μg/L，IC50為0.039 μg/L，檢出限為0.009 μg/L。除AMA與金剛乙胺有部分交叉外，2 種ic-CLEIA方法的特異性良好；優(yōu)化了樣品前處理各項(xiàng)參數(shù)，制定了一種用碳酸鉀和乙酸乙酯同時(shí)提取禽肉中AMA和CAP的樣品前處理方法。在最佳條件下，AMA和CAP的添加回收率分別為92.55%～105.14%和92.00%～112.50%，變異系數(shù)均低于10.48%；經(jīng)儀器方法確證，本方法及樣品前處理方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以滿足禽肉中AMA和CAP兩種藥物的實(shí)際檢測(cè)需求。與蔡云虹[11]、楊麗麗[12]酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法相比，本方法不僅靈敏度和準(zhǔn)確度有了顯著提高，而且能夠應(yīng)用于禽肉產(chǎn)品多殘留藥物的同時(shí)檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。