王曉瑞，邱紅玲，王壽利，朱海華，周 莉，平 洋，譚 靜，王 永，王 慧,,*

（1.河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002；2.上海交通大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，上海 200025；3.中國科學院上海生命科學研究所，上海 200233）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于海水及其海產品中，大量弧菌存在于海洋藻類和動物中，如蝦、魚、雙殼類、血蛤和鮭魚等[1]。人體被弧菌感染之后會導致嚴重的腸胃炎，目前發(fā)現(xiàn)的弧菌大概有46 種，其中至少有12 種弧菌與人類感染有關，包括副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、流感弧菌、溶藻弧菌等[2-8]。在弧菌科中，副溶血弧菌是許多國家引起腸胃炎的主要食源性致病菌[9-12]，當人們攝入被副溶血弧菌污染的生的或未煮熟的食物時，可能會導致急性腸胃炎等相關的疾病，如腹瀉、嘔吐、腹部絞痛和低燒[13]。GB 29921ü 2013《食品中致病菌限量》對水產制品、水產調味品中的副溶血弧菌進行限量，具體為n=5、c=1、m=100 MPN/g（mL）、M=1 000 MPN/g（mL）。

目前用于檢測副溶血弧菌的方法主要有傳統(tǒng)檢測法、聚合酶鏈式反應以及免疫學方法等[14]。傳統(tǒng)檢測方法對于副溶血弧菌表型鑒定通常需要結合各種生化和血清學檢測的顯色瓊脂培養(yǎng)，該方法增菌時間長并且需要耗費大量人力[15]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢，但不能有效用于常規(guī)檢測[16]。免疫學方法是一種靈敏度高、操作簡便的檢測副溶血弧菌的方法，并且該方法不需要專門的儀器和設備[17]。夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法是食品安全檢測過程中常用的方法之一，該方法由于標記酶放大檢測信號的作用，因此具有較高的靈敏度，同時操作過程簡單、可用于大批量樣品的檢測，整個檢測過程可以在2 h之內完成[18-19]。

單克隆抗體由于具有特異性高、均質性好及來源穩(wěn)定并可大批量生產等優(yōu)點，是目前疾病研究、診斷及治療的一種常用手段，隨著單克隆抗體研究及應用的深入，其在病毒性疾病和水產病原細菌性疾病的預防及診斷過程中發(fā)揮著重要作用[20]。外膜蛋白K（outer membrane protein K，OMPK）是一種位于弧菌細胞壁外膜分子質量約為28 kDa的蛋白，該蛋白具有廣泛與外界接觸的機會，它們之間相似性較高，是弧菌主要的表面抗原之一[21]。何彬斌等[22]通過分離純化抗副溶血弧菌雞卵黃免疫球蛋白建立檢測副溶血弧菌的間接ELISA方法，該方法副溶血弧菌的檢出限為1.0h 105CFU/mL，實驗結果具有很強的特異性，能夠準確對副溶血弧菌進行檢測。Pinto等[23]建立了PCR-ELISA檢測副溶血弧菌的檢測方法，該方法的檢測靈敏度較傳統(tǒng)檢測方法提高了100 倍，同時又降低與其他菌株的交叉反應，具有很好的應用前景。竇勇等[24]建立的副溶血弧菌耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）毒素雙抗體夾心檢測方法，以TDH+副溶血弧菌菌體及TDH毒素制備免疫抗原，免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔制備多克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，檢測結果在5 h內完成，并且具有很強的特異性。

本研究將副溶血弧菌外膜蛋白全長OMPK和截短OMPK1基因分別克隆到原核表達載體PET-28a中構建重組質粒PET-28a-OMPK/PET-28a-OMPK1，在感受態(tài)大腸桿菌BL21中誘導表達并純化蛋白，免疫BALB/c小鼠制備重組外膜蛋白OMPK和OMPK1的單克隆抗體，進一步研究抗體不同標記方法及抗體片段對檢測靈敏度的影響，初步優(yōu)化建立副溶血弧菌間接夾心ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮭魚（三文魚）購于超市，血蛤購于菜市場；所有菌株均保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；原核表達載體PET-28a 安諾倫（北京）生物科技有限公司；感受態(tài)大腸桿菌BL21細胞 美國Promega公司；6～8 周SPF級BALB/c雌性小鼠 上海市第二軍醫(yī)大學。

LB培養(yǎng)基 北京陸橋有限公司；Immunopure?Fab Preparation Kit 美國Pierce公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司；弗氏佐劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳低分子質量蛋白標準 美國Sigma公司；T4 DNA連接酶、BamH I、XhoI 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1500-823多功能酶標儀 美國Thermo Scientific公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特有限公司；PCR基因擴增儀、電泳儀、電泳槽 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 副溶血弧菌OMPK基因克隆及表達載體構建

副溶血弧菌DNA提取按照細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）操作說明進行，依據(jù)GenBank記錄的弧菌OMPK基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增引物，全長OMPK基因引物Nompku：CCCGG ATCCATGCGTAA ATCACTTCTAGCTCT；Nompkd：CCCCTAGTTACAGCTACG。截短OMPK1基因引物 OMPKU：CCCGGATATTACCAATTTGGTATGG；OMPKD：CCCCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTAC。PCR擴增產物純化后，用BamH I和XhoI雙酶切轉入PET-28a載體，T4DNA連接酶進行連接，然后分別將轉化產物PET-28a-OMPK與PET-28a-OMPK1轉入感受態(tài)大腸桿菌BL21細胞中，培養(yǎng)過夜，PCR驗證及測序分析挑選陽性菌株。

1.3.2 重組蛋白的表達與純化

陽性菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6，加入1 mmol/L硫代半乳糖苷誘導重組蛋白表達，8 000hg離心5 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）重懸后冰浴超聲菌體30 min，10 000hg離心10 min收取上清液。將上清液結合于Ni2+瓊脂糖親和層析柱，然后PBS洗滌10 次，重組蛋白經(jīng)洗脫緩沖液（20 mmol/L Na3PO4，50 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4）從層析柱上洗脫下來，PBS溶液透析3 次。

1.3.3 單克隆抗體的制備與純化

將純化的OMPK與OMPK1重組蛋白（免疫劑量為50 μg/只小鼠）分別與等體積的弗氏完全佐劑充分混合、乳化，皮下免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠。每隔2 周加強免疫1 次，一共免疫6 次，加強免疫將抗原與弗氏不完全佐劑1∶1混合，第3次與第6次免疫之后經(jīng)Western-blotting測定血清特異性及ELISA方法測定血清效價，從OMPK與OMPK1重組蛋白中選取最佳重組蛋白進行后續(xù)的抗體制備。第6次免疫之后3 d將小鼠脫臼拉頸處死取其脾細胞，骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶5比例充分混合，離心去除上清液，50%的聚乙二醇誘導細胞融合[25]，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止融合。采用ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞制備副溶血弧菌單克隆抗體，通過有限稀釋法對陽性細胞株進行亞克隆3 次，將雜交瘤細胞（106細胞/mL）注入石蠟（0.3 mL/只）預處理的小鼠腹腔中，10 d左右取小鼠腹水，腹水用飽和硫酸銨沉淀后，再經(jīng)Protein-G親和層析柱純化。間接夾心ELISA法測定單克隆抗體效價，抗體亞型鑒定按照小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒說明書進行，Western-blotting檢測抗體的特異性。

1.3.4 單克隆抗體Fab片段的制備及標記

單克隆抗體Fab的制備按照Immunopure?Fab Preparation Kit說明書方法操作，首先向250 μL消化緩沖液中加入250 μL木瓜蛋白酶，靜置10 min，然后6 000hg離心3 min，去除上清液并重復上述步驟3 次。將平衡后的木瓜蛋白酶重懸于250 μL消化緩沖液中，然后將單克隆抗體與消化緩沖液各250 μL混合后加入到250 μL木瓜蛋白酶凝膠中，37 ℃放置8 h。用Ultrafree MC分離器從固定的木瓜蛋白酶中分離消化液，結合緩沖液（250 μL）洗滌木瓜蛋白酶凝膠，收集混合液保存于4 ℃。辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記單克隆抗體（VP3、VP4、VP5、VP6、VP16、VP17）操作方法如下：純化后的單克隆抗體在0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.5）4 ℃條件下透析3 次并輕輕攪拌。10 mg NaIO4溶于0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液，0.25 mL HRP（10 mg/mL）中加入0.25 mL現(xiàn)配NaIO4在25 ℃黑暗條件下氧化20 min，加入100 μL乙二醇終止上述反應。將1 mL透析后的抗體與HRP混合反應3 h，然后向混合液中加入80 μL NaBH4，4 ℃條件下培養(yǎng)1 h。HRP標記的單克隆抗體在4 ℃條件下透析3 次并緩慢攪拌，加入等量甘油保存于-20 ℃。生物素（biotin）標記單克隆抗體操作方法如下：biotin標記方法按照EZ-Link?Sulfo-NHS-LCBiotin kit說明書操作，將1 mL 2 mg/mL的單克隆抗體與27 μL 10 mmol/L biotin混合后冰浴放置2 h，抗體中加入等量的甘油保存于-20 ℃。

1.3.5 ELISA法結合單克隆抗體檢測副溶血弧菌

不同處理方式的單克隆抗體作系列梯度稀釋包被于96 孔板，每個稀釋度做3 個平行，每孔加入100 μL，4 ℃放置過夜。加入200 μL封閉液（10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20+5%牛血清白蛋白）封閉非特異性結合位點，加入100 μL洗滌緩沖液（10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20）洗3 次，副溶血弧菌培養(yǎng)至108CFU/mL，去除培養(yǎng)基，加入2 mL PBS煮沸15 min暴露抗原，然后每孔加入100 μL，放置37 ℃孵育1 h，加入洗滌緩沖液洗3 次[26]。

1.3.5.1 HRP標記單克隆抗體檢測

將HRP標記抗體按1∶1 000比例稀釋，然后取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中，37 ℃孵育1 h，洗滌緩沖液洗3 次，每孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺反應10 min，加入1 mol/L HCl溶液終止上述反應，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度。

1.3.5.2 biotin標記單克隆抗體檢測

將biotin標記的抗體按1∶1 000比例稀釋，取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中，37 ℃孵育1 h，洗滌緩沖液洗6 次，然后加入100 μL磷酸對硝基苯酯反應10 min，0.5 mol/L Na2CO3溶液終止上述反應，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度。

1.3.6 ELISA法檢測海鮮樣品中副溶血弧菌

取鮭魚可食用部分用滅菌剪刀剪碎，稱取25 g鮭魚加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質器中均質30 s，然后分別接種5～10、10～25、25～100 CFU/25 g副溶血弧菌ATCC33847（平板計數(shù)法對菌落進行計數(shù)），37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL增菌液5 000hg離心5 min，菌沉淀用1 mL PBS重懸，將菌液煮沸15 min后，用抗原抗體包被的96 孔板進行檢測。血蛤從菜市場購買，稱取25 g加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質器中均質30 s，37 ℃培養(yǎng)12 h，間接夾心ELISA方法檢測副溶血弧菌。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 Western-blotting檢測結果

圖1 抗血清Western-blotting檢測結果Fig.1 Western-blotting of the purified recombinant protein

全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白用His-tag標簽標記，純化目的蛋白免疫小鼠，取小鼠血清通過Westernblotting方法檢測該血清對副溶血弧菌抗原的特異性。如圖1所示，全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白制備的抗血清均能與副溶血弧菌裂解物起特異性反應。

2.2 血清效價測定結果

間接夾心ELISA法測定anti-OMPK（OMPK抗體）和anti-OMPK1（OMPK1抗體）血清效價。將小鼠血清分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000比例稀釋，小鼠血清效價結果（圖2）表明，血清稀釋度為1∶8 000時anti-OMPK/OMPK效價是anti-OMPK1/OMPK1的2.3 倍，對副溶血弧菌抗原（V.parahaemolyticusantigen，VPA）測定比較，anti-OMPK/VPA效價是anti-OMPK1/VPA的11.1 倍，全長OMPK重組蛋白制備的抗血清效價明顯優(yōu)于截短OMPK1重組蛋白制備的血清，全長蛋白分子質量大，包含的抗原位點多，具有較強的免疫原性，但是截短蛋白會失去一部分抗原表位，影響該蛋白的免疫原型，從而降低后續(xù)免疫小鼠制備的抗體與VPA的親和力[27]。故實驗選擇OMPK重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體。

圖2 anti-OMPK和anti-OMPK1血清效價ELISA檢測結果Fig.2 Measurement of the titer of anti-OMPK serum and anti-OMPK1 serum by indirect ELISA

2.3 抗體特異性

圖3 抗體Western-blotting檢測結果Fig.3 Western blotting of the antibodies

圖3表明，6 株單克隆抗體均能特異性識別副溶血弧菌抗原，后續(xù)將6 株單克隆抗體用HRP或biotin標記，兩兩配對選擇最佳的檢測抗體對。

2.4 酶標抗體最佳工作濃度

如圖4所示，HRP標記的單克隆抗體稀釋度在1∶3 200時，只有VP16-HRP OD450nm大于1，biotin標記的抗體稀釋度為1∶800時，VP4-biotin測定值大于1，不同抗體標記方法不同其最佳工作濃度也有差別。

圖4 不同酶標抗體的ELISA檢測結果Fig.4 ELISA results of HRP or biotin-labeled antibodies

2.5 HRP標記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

表1 HRP標記mAbs檢測副溶血弧菌實驗結果Table 1 Results of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with HRP

由表1可以看出，將HRP標記的單克隆抗體作為檢測抗體用于檢測副溶血弧菌，當副溶血弧菌抗原濃度為109CFU/mL時，VP3-HRP與其他抗體配對檢測結果為副溶血弧菌陽性，但是檢測信號很弱。當副溶血性弧菌抗原濃度為107CFU/mL時，只有VP3-HRP/VP4檢測結果為陽性，其余配對抗體ELISA檢測結果為陰性。

2.6 biotin標記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

表2 biotin標記mAbs檢測副溶血弧菌實驗結果Table 2 Results of detection of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with biotin

表2結果表明，副溶血弧菌ATCC33847抗原濃度為107CFU/mL時，VP3-biotin與VP4、VP5、VP6、VP16、VP17配對用于夾心ELISA法檢測副溶血弧菌，除VP3-biotin/VP4抗體對檢測OD450nm值小于2，其余OD450nm值均大于2，VP16-biotin/VP3抗體對也具有很高的檢測靈敏度，綜上結果可知biotin標記VP3和VP16與特定抗體配對能夠放大檢測信號，進而ELISA方法用于副溶血弧菌檢測具有較高的靈敏度。

2.7 特異性實驗

表3 VP3-biotin抗體對ELISA法檢測副溶血弧菌的特異性Table 3 Specificity analysis of biotinylated VP3 paired with other purified mAbs to detect V.parahaemolyticus by sandwich ELISA

由表3可知，抗體對用于檢測大腸桿菌ATCC35218等1 6 株菌的E L I S A 結果均為陰性，檢測河流弧菌CGMCC1.1611等4 株弧菌屬結果為陰性，說明上述抗體對與其他菌株無交叉反應，副溶血弧菌 ATCC33847等4 株菌的檢測結果均為顯著陽性。表3中的抗體對在用于ELISA方法檢測副溶血弧菌時具有良好的靈敏度及特異性。

2.8 Fab片段檢測靈敏度實驗

表4 VP16-biotin/VP3和VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測副溶血性弧菌靈敏度分析Table 4 Sensitivity analysis of VP16-biotin/VP3 and VP16(Fab)-biotin/VP3 to detect V.parahaemolyticus

VP16 Fab片段與VP16檢測副溶血弧菌結果見表4，副溶血弧菌抗原濃度為107CFU/mL兩者的檢測結果無明顯差異，抗原濃度降低至106CFU/mL，VP16-biotin/VP3抗體對檢測副溶血弧菌OD450nm結果為0.75，VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測OD450nm結果為1.87，其檢測靈敏度明顯高于VP16-biotin/VP3。上述結果與Fab自身特性有關，F(xiàn)ab是分子IgG經(jīng)木瓜蛋白酶裂解產生的2 個相同片段中的任一個，F(xiàn)ab相對分子質量約為5h 104，相比于完整抗體IgG具有分子質量小、無Fc片段、具有很高的結合能力、不需要介導抗體效應就能夠單價結合抗原的特性[28]。兩抗體對用于檢測高濃度豚鼠氣單胞菌抗原時均無交叉反應。

2.9 海鮮樣品檢測結果

表5 海鮮樣品中副溶血弧菌檢測結果Table 5 Results of V.parahaemolyticus detection in seafood samples

ELISA方法結合VP16-biotin/VP3抗體對檢測血蚶和人工污染鮭魚中活的副溶血弧菌，由表5可知，5～10、10～25、25～100 CFU/25 g菌污染濃度下，ELISA檢測結果均為副溶血弧菌陽性，市場購買的血蚶檢測結果也是副溶血弧菌陽性。

3 討論與結論

免疫學方法檢測副溶血弧菌一般是以其毒力因子作為檢測對象，傳統(tǒng)的免疫學檢測方法主要是以相對耐熱溶血素、TDH耐熱溶血素等制備單克隆抗體，以此檢測樣品中的副溶血弧菌[17]。但是除副溶血弧菌外，其他弧菌中也存在毒力基因，因此可能造成漏檢與誤檢[29-30]。外膜蛋白是一類細菌表面蛋白，對于菌體自身結構的維持以及物質轉運功能具有重要作用，該蛋白還有較強的免疫原性[31]。OMPK是副溶血弧菌表面蛋白成分之一，具有較好的免疫原性，很少與其他菌屬發(fā)生交叉反應，因此可避免其他菌屬的干擾造成檢測結果假陽性[32-33]。

本研究結果表明OMPK重組蛋白免疫小鼠血清效價明顯高于OMPK1重組蛋白。經(jīng)OMPK重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備出VP3、VP4、VP6、VP7、VP16、VP17共6 株單克隆抗體均能夠特異性識別副溶血弧菌抗原。HRP標記的單克隆抗體用于檢測副溶血弧菌時檢測信號弱、靈敏度低，VP3-biotin與其他5 個抗體配對和VP16-biotin/VP3檢測副溶血弧菌靈敏度較高。VP3-biotin與其他5 個抗體配對用于ELISA方法檢測對副溶血弧菌同種屬具有良好的特異性，該抗體對用于檢測其他種屬菌并無交叉反應。Fab片段相比于完整抗體用ELISA方法檢測副溶血弧菌具有更高的靈敏度，VP16-biotin/VP3抗體對檢測海鮮樣品中副溶血弧菌的檢測限可達5～10 CFU/25 g。該方法的靈敏度高，可成功用于副溶血弧菌快速檢測等應用研究。