程 慧，馮 灝，李詩瑤，劉 順，周陶鴻，彭青枝

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070；2.荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州 434000）

氟蟲腈是1989年由法國羅納普朗克公司生產(chǎn)的苯基吡唑類廣譜類殺蟲劑，因其可通過胃毒作用抵御害蟲的抗藥性，我國于1994年開始引入使用?，F(xiàn)代毒理學(xué)研究表明，氟蟲腈對害蟲的神經(jīng)膜氯離子通道有強烈的阻礙作用，因其屬于內(nèi)吸性農(nóng)藥，在動物性及植物性農(nóng)產(chǎn)品中殘留量日益得到關(guān)注[1-3]。食品中氟蟲腈及其代謝物的殘留可能會引起人體器官不同程度的損傷，國際食品法及我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定氟蟲腈在蛋類中限量為0.02 mg/kg，并且我國于2009年開始禁用氟蟲腈。近年來氟蟲腈再次得到關(guān)注，主要源于歐洲地區(qū)發(fā)現(xiàn)了被氟蟲腈污染的雞蛋，經(jīng)過相關(guān)部門調(diào)查表明目前市場上所用消毒液中可能含有氟蟲腈，養(yǎng)雞場使用混有氟蟲腈的消毒液后進(jìn)而間接引起雞蛋污染[4-6]。在“毒雞蛋”事件之前，我國對于雞蛋的污染物檢測項目中未規(guī)定氟蟲腈的檢測方法及最大殘留限量，但這并不表示我國生產(chǎn)的雞蛋不存在氟蟲腈的污染[7-9]。

市場監(jiān)管總局在2019年12月發(fā)布了關(guān)于公開征集23 項食品快速檢測方法的公告，其中13 項明確規(guī)定使用膠體金免疫法，將通過化學(xué)方法合成羧基修飾的目標(biāo)分子與牛血清白蛋白鍵合成免疫原，膠體金免疫法的技術(shù)核心是合成羧基修飾的目標(biāo)分子，即實現(xiàn)目標(biāo)分子與羧基的連接。然而以小分子為模板形成的半抗原篩選抗體存在不確定性，每一次進(jìn)行動物免疫實驗的結(jié)果得出的抗體特異性存在差異，以此為基礎(chǔ)建立的膠體金免疫法快速檢測目標(biāo)分子的不確定性同時也會增加。通過核酸適配體建立的比色法快速分析食品中小分子污染物是目前現(xiàn)場檢測研究的重點項目，核酸適配體是體外合成的人工抗體，經(jīng)過篩選試劑盒的分析得到與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體，建立適配體傳感器放大識別信號直接獲得目標(biāo)分子的濃度，通過對識別信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)衍生出電化學(xué)法、熒光法、比色法等適配體傳感器[10-13]。

在核酸適配體傳感器中與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的適配體還有相對應(yīng)的信號適配體，信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過修飾信號適配體實現(xiàn)。適配體因合成的特殊性易于標(biāo)記和修飾，連接活性基團后結(jié)合納米材料和生物酶是適配體傳感器實現(xiàn)信號放大的常用方法，將生物酶催化底物顯色反應(yīng)與適配體結(jié)合實現(xiàn)比色傳感器非常符合食品中小分子污染物快速檢測的要求，直接目視比色以快速判定食品中小分子污染物的含量，為食品的現(xiàn)場檢測分析帶來新的思路[13-16]。生物酶直接標(biāo)記納米材料是有限的，若將生物酶提前聚合再與納米材料結(jié)合所達(dá)到的催化效果將遠(yuǎn)大于直接標(biāo)記，同理在催化反應(yīng)完成后將產(chǎn)物再次富集沉淀，加入終止劑分解與顯色劑顯色，這比直接催化底物顯色更加穩(wěn)定[17-19]。另外將識別小分子污染物的核酸適配體與納米磁珠結(jié)合，使整個體系的分離與檢測更加便利，進(jìn)一步實現(xiàn)信號的放大和識別效應(yīng)的加強[20]。本實驗基于納米磁珠-適配體識別雞蛋中氟蟲腈，利用金納米粒子-聚合酶螯合物連接信號適配體與識別基質(zhì)結(jié)合后，因聚合酶螯合物上聚集的脲酶可催化分解尿素，向反應(yīng)體系中加入銅離子生成沉淀，加入銅離子顯色劑后沉淀分解產(chǎn)生紅色配合物，此時紅色配合物的吸光度大小間接反映了與識別基質(zhì)結(jié)合的氟蟲腈含量大小，通過2 種納米材料及聚合酶螯合物的信號放大，使本方法對于雞蛋中氟蟲腈的檢測限可應(yīng)用于食品中小分子污染物的快速檢測（圖1）。本實驗所用檢測方法目前國內(nèi)外鮮見報道，但是利用聚合酶螯合物實現(xiàn)食品中小分子污染物快速檢測分析是近幾年研究信號放大降低檢測限的熱點[14]，此檢測方法的創(chuàng)新之處在于首次將可視化的分光檢測與酶催化反應(yīng)相結(jié)合實現(xiàn)基于核酸適配體的小分子污染物快速檢測，對于其他農(nóng)藥或獸藥的檢測尚在研究探索[18-20]。

圖1 基于互補鏈反應(yīng)及聚合酶螯合物顯色反應(yīng)的比色分析原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of colorimetric analysis based on complementary chain reaction and chromogenic reaction of polymerase chelate

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋樣品 市購。

羧基磁珠（粒徑1.0～2.0 mm，10 mg/mL） 美國C h a r m 生物科技有限公司；4-嗎啡啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、尿素（98%）、6-巰基己醇 美國Sigma-Aldrich公司；聚合酶螯合物 上?；蚩萍加邢薰?；氯金酸、五水合硫酸銅、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、鹽酸、胱氨酸、碳酸鉀、銅離子顯色劑 國藥集團化學(xué)試劑上海有限公司；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚標(biāo)準(zhǔn)品 北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；聚合酶螯合物（EnVisionTM） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

實驗中所用氟蟲腈適配體（1）和互補適配體（2）均由上海生工生物工程有限公司提供，根據(jù)以下堿基序列定制合成：（1）5’-S H2-(C H2)6-ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT-3’；（2）5’-NH2-(CH2)6-ACCCCCAACTCCGATTCGTCGGCT-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-100恒溫混勻儀 杭州佑寧儀器有限公司；UV-1901紫外-可見分光度計 北京普析通用儀器有限公司；4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 氟蟲腈適配體的篩選

隨機文庫的固定：取2 nmol初篩文庫與6 nmol生物素標(biāo)記序列混合后，在金屬浴中95 ℃水浴10 min，30 ℃振蕩反應(yīng)1 h，直到初始文庫與生物素標(biāo)記序列互補配對。進(jìn)一步與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠在30 ℃條件下振蕩反應(yīng)1 h，用50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2和5 mmol/L CaCl2）洗滌3 次，磁分離后除去未結(jié)合部分。正向篩選：取100 μg/kg氟蟲腈溶液加入到初篩的隨機文庫中，在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)1 h后，于4 ℃反應(yīng)過夜，磁分離后得到氟蟲腈結(jié)合的適配體上清液。反向篩選：取100 μg/kg氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚混合液加入到初篩的隨機文庫中，在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)1 h后，于4 ℃反應(yīng)過夜，磁分離后得到未結(jié)合的適配體，再對其進(jìn)行正向篩選得到結(jié)合的適配體。分離：將上清液加入2 μL 5 mg/mL糖原、50 μL 3 mol/L醋酸鈉和1 400 μL無水乙醇，混勻后-20 ℃靜置過夜，12 000 r/min冷凍離心10 min，棄去上清液，再加入1 mL 70%乙醇溶液復(fù)溶后12 000 r/min冷凍離心10 min，最后用100 μL無菌ddH2O復(fù)溶待用。以80、60、40 μg/kg和20 μg/kg的氟蟲腈溶液重復(fù)對初篩核酸文庫進(jìn)行正向篩選、反向篩選[21-24]。

PCR擴增反應(yīng)液體系：氟蟲腈親和性適配體模板鏈20 μL，20 μg/mL上、下游引物各20 μL，2h EsTaqMaster Mix (Dye) 25 μL，用無菌ddH2O補至100 μL。PCR擴增條件為三階段循環(huán)：94 ℃變性330 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸320 s。利用凝膠電泳分離和寡聚核苷酸純化試劑盒純化后進(jìn)行測序。

1.3.2 信號適配體探針的制備

首先，將取500 μL已溶解的100 mL 1%氯金酸溶液，加入49.5 mL二級水，待該溶液加熱至沸騰后邊攪拌邊加入1.25 mL 10 mg/L檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱至沸騰后停止加熱，冷卻至室溫待用。取2.0 mL制備好的金納米粒子，加入0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5后與150 μg聚合酶螯合物攪拌過夜，離心除去未結(jié)合的物質(zhì)。接著，取3 μg巰基化的互補適配體加入金納米粒子-聚合酶螯合物體系中4 ℃振蕩過夜，離心分離后加入巰基己醇封閉多余位點；最后得到金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體復(fù)合物，4 ℃靜置過夜保存待用[25-28]。

1.3.3 磁珠與識別適配體的結(jié)合

識別氟蟲腈的適配體經(jīng)過氨基修飾可與羧基化磁珠通過化學(xué)鍵結(jié)合，利用EDC和NHS進(jìn)行酰胺反應(yīng)活化羧基磁珠，之后在其表面共價結(jié)合識別適配體制備反應(yīng)基質(zhì)。取4 μL 25 mg/mL羧基功能化磁珠，加入100 μL溶于pH 6.0 MES溶液中的2 mg/mL EDC和1 mg/mL NHS活化磁珠2 h，分離洗滌磁珠，加入10 μg識別適配體，在恒溫振蕩器中保持4 ℃振蕩過夜，用pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液反復(fù)洗滌磁珠-適配體復(fù)合物，加入胱氨酸作為封閉劑，再洗滌分離得到復(fù)合物4 ℃保存待用[29-31]。

1.3.4 比色適配體傳感器的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

將上述實驗合成的過量金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體與100 μL磁珠-適配體復(fù)合物混合，室溫振蕩2 h，磁分離得到信號適配體與識別適配體的結(jié)合物。進(jìn)一步與100 μL不同濃度的氟蟲腈溶液和雞蛋提取液在室溫振蕩反應(yīng)30 min，由于識別適配體與氟蟲腈的特異性識別使金納米粒子-聚合酶螯合物-信號適配體分離出來，隨后向分離的探針中加入30 mmol/L尿素和20 mmol/L銅離子混合溶液100 μL，室溫振蕩反應(yīng)10 min離心分離，加入銅離子顯色溶液所得產(chǎn)物用于比色分析，建立吸光度與氟蟲腈濃度之間的線性關(guān)系。

雞蛋樣品前處理：稱取3 g打散的雞蛋置于15 mL離心管中，加入2 mL乙酸乙酯，輕微顛倒30余次提?。嵉共荒軇×乙苑廊榛? 000 r/min離心5 min，取0.5 mL有機層溶液空氣吹干，用0.2 mL pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液復(fù)溶渦旋混勻待檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號探針的表征

通過檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子，由于聚合酶螯合物中富集大量脲酶和抗體，金納米粒子和聚合酶螯合物通過靜電吸附作用結(jié)合后形成復(fù)合物，復(fù)合物與信號適配體的巰基通過Auü S鍵結(jié)合形成新的信號探針，實驗通過透射電鏡及紫外分光光度計驗證復(fù)合物與信號探針的結(jié)合過程。如圖2所示，金納米粒子的平均粒徑約為13 nm，連接聚合酶螯合物之后平均粒徑明顯增加，表明金納米粒子與聚合酶螯合物成功結(jié)合。如圖3所示，金納米粒子在波長500 nm左右有一個特征吸收峰（曲線a），互補適配體在波長350 nm處有一個特征吸收峰（曲線c），信號探針合成后的紫外表征曲線b在波長350 nm和500 nm處均有吸收峰，證明信號探針的制備符合實驗要求。

圖2 金納米粒子（A）、互補適配體探針（B）透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy images of gold nanoparticles (A) and complementary aptamer probes (B)

圖3 金納米粒子紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of gold nanoparticles

2.2 磁珠-適配體的表征

圖4 50 mg/kg氟蟲腈、空白對照用于比色分析的紫外-可見吸收光譜曲線Fig.4 UV-visible absorption spectra of flufenitrile at 50 mg/kg and blank control for colorimetric analysis

本方法基于適配體連接納米磁珠進(jìn)行雞蛋中氟蟲腈的分析檢測，通過氟蟲腈核酸適配體引發(fā)雜交鏈反應(yīng)，并進(jìn)一步結(jié)合聚合酶螯合物雙功能化金納米粒子標(biāo)記物制備的納米探針復(fù)合物，用于所得產(chǎn)物溫育反應(yīng)?；诖胖檫B接的核酸適配體與其互補鏈之間的結(jié)合作用，使得金納米探針得以成功捕獲從而形成磁性復(fù)合物。利用該復(fù)合物上定量捕獲的高含量脲酶分子的酶催化生物礦化作用，以及進(jìn)一步溶解釋放礦化富集的銅離子進(jìn)行腙類顯色劑(E)-1,2-二苯基-2-(2-(吡啶-2-基)亞肼基)乙酮E配位顯色反應(yīng)，從而可以成功實現(xiàn)本方法的比色信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。實驗通過紫外-可見吸收光譜法考察本方法發(fā)展的上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)策略對靶向分析物氟蟲腈的信號響應(yīng)情況。如圖4所示，當(dāng)將50 mg/kg氟蟲腈用于比色反應(yīng)后，所得顯色溶液產(chǎn)物在波長502 nm處出現(xiàn)了一個很強的紫外-可見吸收峰；當(dāng)沒有將所得磁性復(fù)合物經(jīng)過稀酸溶解處理時，所得產(chǎn)物溶液在300～700 nm波長范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的特征吸收。同時，當(dāng)在構(gòu)建的磁珠平臺上進(jìn)行空白對照實驗時，所得產(chǎn)物經(jīng)顯色處理之后只得到十分微弱的背景信號。這一結(jié)果充分證明了本磁珠分析平臺上夾心免疫識別反應(yīng)的成功進(jìn)行以及該工作設(shè)計的比色信號轉(zhuǎn)導(dǎo)策略的可行性。

2.3 條件優(yōu)化

為了保證金納米粒子-聚合酶螯合物納米標(biāo)記物的最佳酶催化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，實驗首先將不同用量的聚合酶螯合物和過量適配體互補鏈依次加入到1.5 mL制備好的金納米粒子中進(jìn)行納米標(biāo)記物的制備，然后將制備的幾種不同產(chǎn)物分別用于50 mg/kg氟蟲腈在構(gòu)建的磁性分析平臺上的比色分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。從圖5A可以看出，實驗所得顯色產(chǎn)物的吸光度響應(yīng)值首先隨著聚合酶螯合物用量的增加而增大；當(dāng)適配體互補鏈的用量大于3 μg后，顯色產(chǎn)物的吸光度響應(yīng)開始緩慢下降。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因應(yīng)該是：當(dāng)金納米粒子表面負(fù)載的適配體互補鏈量較少時，不能提供足夠的脲酶以用于分解尿素產(chǎn)生顯色物質(zhì)；但是，由于金納米粒子表面空間的制約，過量的適配體互補鏈則會導(dǎo)致制備所得的納米標(biāo)記物上聚合酶螯合物的負(fù)載量減少，從而減弱傳感器的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。本實驗以3 μg適配體互補鏈和150 μg聚合酶螯合物作為納米標(biāo)記物制備的最佳用量。

在進(jìn)行互補鏈反應(yīng)時，充當(dāng)生物識別的氟蟲腈適配體用量和雜交鏈反應(yīng)時間均為影響反應(yīng)效率的重要因素。實驗首先研究了在不同濃度氟蟲腈適配體條件下，50 mg/kg氟蟲腈在構(gòu)建的磁珠分析平臺上的紫外-可見光譜響應(yīng)。如圖5B所示，隨著氟蟲腈適配體用量不斷增加，所得顯色產(chǎn)物的吸光度也隨之增加；當(dāng)氟蟲腈適配體用量大于10 μg之后，其所得顯色產(chǎn)物吸光度開始趨向于一個穩(wěn)定值。該結(jié)果說明，用量為10 μg的氟蟲腈適配體足夠識別磁珠平臺上捕獲的氟蟲腈，以實現(xiàn)其比色信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為此，將10 μg氟蟲腈適配體用量用作本工作的最佳實驗條件。同時，還對互補鏈反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。如圖5C所示，隨著反應(yīng)時間的延長，所得顯色產(chǎn)物的吸光度不斷增加；當(dāng)該時間延長至50 min之后，吸光度響應(yīng)開始趨于穩(wěn)定。這說明50 min足以使互補鏈反應(yīng)完全進(jìn)行，從而達(dá)到該方法的最佳信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大。圖5D顯示磁珠復(fù)合物與互補鏈及聚合酶螯合物修飾的金納米粒子和氟蟲腈反應(yīng)時間變化對信號響應(yīng)的影響，隨著反應(yīng)時間的延長，信號響應(yīng)隨之增加；當(dāng)反應(yīng)時間延長至30 min后信號響應(yīng)強度趨于穩(wěn)定，這表示適配體與氟蟲腈反應(yīng)飽和。因此，選擇30 min作為最佳反應(yīng)時間。

圖5 各因素對50 mg/kg氟蟲腈紫外-可見吸收響應(yīng)的影響Fig.5 Effects of various factors on the UV-visible absorption response of flufenitrile at 50 mg/kg

2.4 性能分析

在上述最佳條件下，實驗考察不同濃度氟蟲腈在制備的磁性傳感平臺上的紫外-可見吸收光譜響應(yīng)。結(jié)果表明，在0.1 μg/kg～50 mg/kg范圍內(nèi)，其吸光度與氟蟲腈含量的對數(shù)值之間成良好線性關(guān)系，線性回歸方程為A=0.582 33+0.010 21lgC，R2=0.998。在3 倍信噪比條件下，計算得到本方法的檢測限為0.072 μg/kg。

2.5 特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和可靠性

為了進(jìn)一步驗證本實驗開發(fā)比色適配體傳感器的特異性和選擇性，選擇相同類型的50 mg/kg溴蟲腈、氟蟲脲、定蟲隆、三氟氯氰菊酯作為交叉反應(yīng)的目標(biāo)物，日常監(jiān)督抽檢過程中陽性樣品中此5 種農(nóng)藥的檢出率較高，且目前用于該5 種農(nóng)藥的快速檢測方法仍在研究中，故選擇此5 種類型農(nóng)藥作為檢驗氟蟲腈的特異性。實驗分別考察在構(gòu)建的磁珠免疫分析平臺上交叉反應(yīng)。從圖6可以看出，氟蟲腈目標(biāo)分析物在磁珠平臺上具有十分明顯的吸收光譜響應(yīng)，而溴蟲腈、氟蟲脲、定蟲隆、三氟氯氰菊酯沒有表現(xiàn)出較空白對照實驗更為明顯的信號響應(yīng)。這一結(jié)果表明，該比色分析方法具有較好的特異性。為進(jìn)一步證明該方法對于化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物的特異性，分別研究氟蟲腈的主要代謝物如氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈在含量為5 mg/kg時本方法檢測結(jié)果均為陽性，說明本檢測方法與GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》同樣適用于氟蟲腈和氟蟲腈的主要代謝物的檢測。

圖6 試劑空白和5 種農(nóng)藥在磁珠分析平臺上的吸收強度響應(yīng)Fig.6 Absorption intensity of reagent blank, bromozoonitrile fluolin and fluozoonitrile at 50 mg/kg on the magnetic bead analysis platform

同時，本工作還利用發(fā)展的信號策略考察不同含量氟蟲腈在通過相同實驗方法構(gòu)建的磁珠傳感平臺上的重復(fù)實驗結(jié)果。當(dāng)氟蟲腈含量分別為0.01、0.1 mg/kg和10 mg/kg時，5 次重復(fù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.6%、4.2%和2.7%。此外，制備的適配體磁珠和金納米粒子標(biāo)記物均于4 ℃條件下保存，2 周之后，將其用于含量為50 mg/kg氟蟲腈的分析測定，仍然可以保持97.5%以上初始信號響應(yīng)。這些結(jié)果表明，該比色免疫分析方法具有較為滿意的重復(fù)性和穩(wěn)定性。為進(jìn)一步考察該方法的分析可靠性和準(zhǔn)確性，實驗還將其用于從農(nóng)貿(mào)市場和超市購買的雞蛋進(jìn)行檢測。按照1.3.4節(jié)方法處理。按照GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》作為參考方法對樣品進(jìn)行檢測。氟蟲腈加標(biāo)樣品含量分別為5.0、20.0 mg/kg和50.0 mg/kg，通過本方法、傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫和參考方法對加標(biāo)前后的含量分別進(jìn)行檢測。如表1所示，樣品回收率為93.1%～100.6%，3 種方法的檢測結(jié)果一致，表明該方法用于雞蛋中氟蟲腈的檢測是可行的，本方法在操作簡便性和準(zhǔn)確性上均符合市場需求，能夠滿足基層市場對于現(xiàn)場快速檢測的基本需求。

表1 本方法與參考方法測定雞蛋中氟蟲腈含量結(jié)果對比Table 1 Comparison of recoveries and RSD values of fluoronitrile in spiked eggs by this method and conventional methods

2.6 傳感器的假陰性和假陽性評價

表2 本方法測定雞蛋加標(biāo)樣品的假陰性率和假陽性率Table 2 False negative rates and false positive rates calculated for detection of negative egg samples spiked with various concentrations of fluoronitrile by this method

將經(jīng)過預(yù)處理的雞蛋陰性樣品中分別加入不同含量氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，根據(jù)原食藥總局頒布的《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》[32]中快速檢測方法性能指標(biāo)計算假陰性率（假陰性總數(shù)/試驗樣品總數(shù)）和假陽性率（假陽性率總數(shù)/試驗樣品總數(shù)），每個濃度設(shè)置20 組實驗，本實驗陽性樣品參照GB 2763ü 2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[33]制定（蛋類中氟蟲腈殘留量≤0.02 mg/kg）。如表2所示，本實驗構(gòu)建的雞蛋中氟蟲腈快速檢測方法與傳統(tǒng)實驗室檢測方法相比較，得出本檢測方法的假陰性率和假陽性率分別為5%和10%，符合2017年及2019年頒布的KJ系列食品快速檢測方法技術(shù)要求（≤10%）。

3 結(jié) 論

基于磁珠的互補鏈反應(yīng)、識別及顯色反應(yīng)，本實驗成功建立一種可用于氟蟲腈高靈敏檢測的比色分析新方法。本檢測方法基于磁珠構(gòu)建分析平臺簡化了相關(guān)操作，從而進(jìn)一步縮短溫育反應(yīng)時間；引入適配體可提高識別作用的特異性，為結(jié)合互補鏈反應(yīng)和納米標(biāo)記物的酶致生物礦化作用進(jìn)行分析信號的放大提供了可能性?；阢~離子的高效富集、方便釋放與快速、可視化的顏色反應(yīng)，進(jìn)行比色信號轉(zhuǎn)導(dǎo)策略的構(gòu)建，較好彌補了傳統(tǒng)方法中直接利用酶催化顯色反應(yīng)進(jìn)行比色信號的檢出限偏低。故本方法有望在食品中小分子污染物分析領(lǐng)域發(fā)揮較好的實用價值。