吳佳南，孫 娜,2，林松毅,2，吳汶飛,2,*

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

硒是人體必需的微量元素之一[1]，具有抗氧化、保護生物膜和提高機體免疫力的作用[2]。缺硒會導致許多疾病，如克山病等[3]。與無機硒相比，有機硒能主動穿過腸壁，人體可以有效地把硒貯存、積累在靶組織內(nèi)，供機體利用[4]。因此開發(fā)生物活性高的有機硒非常必要[5]。

新西蘭長尾鱈是新西蘭主要的經(jīng)濟魚類，年產(chǎn)量20萬 t[6]，廣泛作為水產(chǎn)品加工的原料。新西蘭長尾鱈平均大小為60～100 cm，質(zhì)量為1～3.5 kg[7]。近年來，魚肉加工業(yè)在美國、歐洲、日本、澳大利亞和中國發(fā)展迅速，由此也產(chǎn)生了副產(chǎn)物難以處理的問題，如鱈魚皮常被丟棄，不僅造成資源的浪費，而且污染環(huán)境[6]。鱈魚皮干物質(zhì)中明膠占70%以上，是生產(chǎn)明膠的良好來源。與其他冷水魚類相比，新西蘭長尾鱈魚皮明膠具有較好的理化性能[8]。當前，國內(nèi)外以明膠為原料制備鈣、鐵、鋅螯合肽的研究較多[9-12]，而有關明膠硒螯合肽的研究鮮有報道。目前，已有研究以無機硒為硒源，通過多肽螯合的方式制備出有機硒[13-15]。因此，以新西蘭鱈魚皮為原料，提取明膠，制備并表征肽硒復合物，具有重要的現(xiàn)實意義，其既能滿足人體對硒元素的需要，又能達到補充膠原蛋白的作用。

本研究以鱈魚皮為原料提取明膠后，經(jīng)不同種類的酶進行酶解制備多肽，與硒離子結(jié)合制備出鱈魚皮明膠肽硒復合物，采用紅外、紫外、熒光、拉曼光譜和圓二色譜對肽硒結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)進行比較，推測肽硒復合位點，運用激光粒徑儀、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡和X射線衍射觀察二者形貌特征和結(jié)構(gòu)的差異。旨在為鱈魚皮資源高值化利用提供新的思路，為肽硒復合物的產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新西蘭長尾鱈魚皮 青島益和興食品有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；風味蛋白酶丹麥諾維信公司；3,3’-二氨基聯(lián)苯胺、鹽酸、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XRD-7000 X射線衍射儀 日本Shimadzu公司；F-2700熒光分光光度計、LA8080氨基酸自動分析儀、AFM550原子力顯微鏡 日本Hitachi公司；Spectrum 10傅里葉變換紅外光譜儀 珀金埃爾默公司；JSM-7800F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；J-1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 鱈魚皮明膠的制備

參照Hou Hu等[16]的方法將鱈魚皮剪成1 cmh 1 cm小片沖洗干凈，室溫下在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡并攪拌0.5 h，料液比為1∶6（g/mL），將非膠原蛋白成分除去后，用蒸餾水洗至中性，室溫下用0.1 mol/L HCl溶液浸泡并攪拌0.5 h，料液比為1∶6（g/mL），得到溶脹的魚皮，洗至中性。把魚皮和蒸餾水混合（1∶10，g/mL），65 ℃提取4 h，8 000hg、4 ℃離心20 min，收集上清液，凍干得到鱈魚皮明膠。

1.3.2 氨基酸組成分析

參照Sun Na等[17]方法測定氨基酸組成。20 mg明膠在110 ℃、6 mol/L HCl溶液和真空安瓿瓶中水解24 h，蒸發(fā)皿蒸干后，用0.02 mol/L HCl溶液定容至25 mL，過0.22 μm濾膜。用氨基酸自動分析儀進行分析。

1.3.3 羥脯氨酸含量的測定

按照Liu Yang等[18]的方法進行測定。稱取干基樣品0.02 g于安醅瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液3 mL，酒精噴燈密封，于烘箱130 ℃放置4 h進行水解。冷卻后倒入燒杯中，滴1 滴甲基紅試劑，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6.0，定容至25 mL。取1 mL上述溶液，加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL氯銨T，渦旋振蕩，室溫反應10 min。加入1 mL 3.5 mol/L的高氯酸溶液，渦旋振蕩，室溫反應10 min，加入1 mL發(fā)色劑（4 g對二甲基氨基苯甲醛、14 mL 6%高氯酸、26 mL異丙醇），振蕩，65 ℃水浴中顯色反應20 min。冷卻30 min，560 nm波長處測量吸光度。以羥脯氨酸作為標準品，繪制標準曲線進行定量分析。

1.3.4 鱈魚皮明膠的酶解工藝

參照Wu Wenfei等[11]的方法，將明膠分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶3 種酶在各自最適酶解溫度和pH值條件下水解鱈魚皮明膠120 min，酶解條件：胃蛋白酶（37 ℃，pH 2.0）、胰蛋白酶（37 ℃，pH 7.5）、風味蛋白酶（5 0 ℃，p H 7.0），明膠質(zhì)量濃度為20 mg/mL，加酶量4%。酶解結(jié)束后，水解液在沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，10 000hg離心20 min，收集上清液，凍干。

1.3.5 鱈魚皮明膠肽硒復合物的制備

參照包怡紅等[13]的方法，將0.5 mol/L的亞硒酸鈉溶液和鱈魚皮明膠多肽溶液以體積比1∶2充分混勻，調(diào)節(jié)pH值至9.0，在80 ℃水浴中反應1 h后冷卻，4 000hg、10 min離心取上清液，加入5 倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，4 000hg、10 min離心取沉淀，無水乙醇洗滌數(shù)次后凍干，得到硒復合物粉末。

1.3.6 硒含量的測定

采用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法[19]測定硒含量。

樣品處理：稱取試樣0.1 g，加入5 mL消化液，低溫消化至樣液呈無色透明。冷卻后，轉(zhuǎn)入燒杯，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后定容到50 mL，待測。

標準曲線的測定：分別取5 μg/mL的硒標準溶液0、2、4、6、8、10 mL，置于125 mL分液漏斗中，用水稀釋成40 mL，調(diào)pH值至2.0，加入EDTA-Na2溶液2 mL，加入3,3’-二氨基聯(lián)苯胺溶液2 mL，搖勻。于暗處反應50 min，取出，調(diào)pH值至7.0，加入10 mL甲苯，振搖2 min，靜置分層，在420 nm波長處測定甲苯層吸光度。

樣品中硒含量的測定：吸取消化處理好的樣品20 mL，置于分液漏斗中，按照標準曲線進行操作。根據(jù)樣品測得的吸光度，按式（1）計算硒含量：

式中：ρ為從標準曲線中查得相當于硒的標準質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為甲苯萃取所得的樣品體積/mL；M為樣品質(zhì)量/g；N為用于測定的樣品占總定容后樣品的體積分數(shù)/%。

1.3.7 鱈魚皮明膠肽硒復合物結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 紫外-可見光譜分析

將鱈魚皮明膠肽與肽硒復合物粉末樣品溶于超純水中，配成1 mg/mL溶液，用紫外-可見分光光度計在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描[20]。

1.3.7.2 熒光光譜分析

將鱈魚皮明膠肽與肽硒復合物凍干粉溶于超純水中，配制成10 mg/mL溶液，采用熒光光譜儀測定，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為290～520 nm波長范圍內(nèi)熒光值的變化[21]。

1.3.7.3 粒徑分布

采用激光粒度儀測定鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的平均粒徑。用純凈水清洗樣品池直至背景清晰。將處理好的待測樣品緩慢加入樣液池中，測試溫度為25 ℃，每個樣品掃描3 次，取平均值[22]。

1.3.7.4 原子力顯微鏡分析

用原子力顯微鏡觀察鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的表面形態(tài)。將10 μL樣品置于新鮮剝離的云母上，室溫下干燥。原子力顯微鏡在輕敲模式下工作，掃描驅(qū)動頻率為340 kHz[23]。

1.3.7.5 掃描電子顯微鏡分析

將適量的多肽粉末與肽硒復合物的凍干粉末樣品分別均勻涂抹于樣品盤，噴金鍍膜處理，施加電壓聚焦清晰后，放大5 000 倍和30 000 倍獲取圖像[24]。

1.3.7.6 X射線衍射分析

取一定量的樣品放在樣品槽中，在加速電壓40 kV、加速電流40 mA、掃描范圍（2θ）10°～70°、掃描速度0.02°/0.2 s的條件下對樣品進行掃描，利用X射線衍射圖譜分析其結(jié)構(gòu)[25]。

1.3.7.7 紅外光譜分析

將鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物凍干粉各2 mg混入200 mg干燥的KBr粉末，于瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片，后進行紅外光譜掃描，掃描范圍4 000～400 cm－1。掃描圖譜通過軟件進行分析[26]。

1.3.7.8 拉曼光譜分析

將樣品平鋪在玻璃載玻片上，在532 nm波長激發(fā)下進行拉曼光譜分析。鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的掃描范圍為800～4 000 cm－1。光譜基線校正和峰分配采用labspec 6軟件進行分析[27]。

1.3.7.9 圓二色譜分析

用超純水配制1 mg/mL的鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物溶液，室溫下1 cm的路徑，波長范圍為190～260 nm，每個樣品掃描3 次，取平均值[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 2018軟件進行作圖，以表示，每個樣品做3 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚皮明膠的氨基酸組成分析

表1 鱈魚皮明膠的氨基酸組成分析Table 1 Amino acid composition of hoki skin gelatin

由表1可知，鱈魚皮明膠具有典型的明膠氨基酸組成的特點，甘氨酸含量最多，占總氨基酸含量24.64%，表明鱈魚皮明膠分子結(jié)構(gòu)中存在(Gly-X-Y)n的重復結(jié)構(gòu)，這種氨基酸組成對維持明膠分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用[29]。亞氨酸（脯氨酸和羥脯氨酸）是明膠的特征氨基酸，質(zhì)量分數(shù)為16.55%。酪氨酸、組氨酸、異亮氨酸含量較低，且不含有胱氨酸。谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸質(zhì)量分數(shù)分別為10.26%、7.77%、6.31%、4.79%和4.62%。

2.2 硒含量的測定結(jié)果

分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶酶解鱈魚皮明膠得到3 種鱈魚皮明膠肽，以亞硒酸鈉為硒源，制備出3 種肽硒復合物，測定其中硒結(jié)合量。如圖1所示，胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量達到4.84 μg/mg，而胃蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量為13.61 μg/mg，風味蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量13.05 μg/mg。胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量顯著低于胃蛋白酶酶解物和風味蛋白酶酶解物（P＜0.05），胃蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。胃蛋白酶屬于消化性蛋白酶，由胃部的胃黏膜主細胞分泌。因此，用胃蛋白酶酶解所得的鱈魚皮明膠肽硒復合物在消化道中較為穩(wěn)定。綜上所述，選用胃蛋白酶酶解所得的鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物進行后續(xù)實驗。

圖1 不同酶酶解獲得的鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合量Fig.1 Selenium-binding capacity of hoki skin gelatin hydrolysates produced with different enzymes

2.3 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物紫外-可見光譜和熒光光譜分析

圖2 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的紫外-可見光譜圖（A）和熒光光譜圖（B）Fig.2 UV-Vis spectra (A) and fluorescence spectra (B) of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

如圖2A所示，280 nm波長附近的吸收帶與芳香氨基酸殘基的吸光度有關。硒離子與鱈魚皮明膠肽結(jié)合后，波長280 nm左右的吸收帶強度明顯增大且紅移。這可能與發(fā)色團（—C＝O，—COOH）和助色團（—OH，ü NH2）的偏振有關。因此推測鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合生成了新物質(zhì)而導致其吸收峰變化。通常復合物的生成會使其配位體對光吸收性能發(fā)生改變，說明鱈魚皮明膠肽和硒結(jié)合發(fā)生了價電子躍遷，證明兩者之間發(fā)生了結(jié)合反應。

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香氨基酸可在特定的激發(fā)波長產(chǎn)生內(nèi)源性熒光[20]。由圖2B鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物熒光光譜圖發(fā)現(xiàn)，鱈魚皮明膠肽的最大吸收峰為311 nm，這與酪氨酸殘基有關。肽硒結(jié)合后，肽硒復合物的吸收峰遷移至355 nm，熒光強度顯著減弱，可能是由于硒離子的熒光猝滅作用。Sun Na等[30]的研究表明，礦物質(zhì)離子能夠引起肽的折疊。因此，水溶液中的硒離子可能會引起肽的折疊，形成肽硒復合物，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生與礦物質(zhì)離子和蛋白肽反應導致熒光強度降低類似的結(jié)果類似。

2.4 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的粒徑分析

將粒徑分布分為3 種粒徑范圍：＜5 0 0 n m、500～1 000 nm、＞1 000 nm，并計算其峰面積，分析各粒徑范圍所占比例。如圖3所示，鱈魚皮明膠肽的大小分布由649.4 nm和1 553.5 nm兩個峰組成，鱈魚皮明膠肽與硒相互作用后，大小分布集中在一個峰上，其粒徑為296.2 nm。粒徑的變化歸因于結(jié)合反應過程中鱈魚皮明膠肽與硒離子之間發(fā)生了結(jié)構(gòu)折疊，這與Ye Qianwen等[31]的研究結(jié)果類似，大豆肽硒螯合后粒徑由連續(xù)分子質(zhì)量分布的肽減小成大小一致的顆粒。同時，這一結(jié)果也進一步證實了熒光光譜的結(jié)論，硒離子的存在引起肽折疊聚集而形成鱈魚皮明膠肽硒復合物。此外，顆粒的尺寸分布證明結(jié)合反應后得到均勻的復合物。

圖3 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的粒徑分析Fig.3 Particle size distribution of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

2.5 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物微觀結(jié)構(gòu)分析

圖4A1、B1顯示了鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的表面形態(tài)，可以看出精確的顆粒大小分布。圖4A2、B2顯示了三維圖像，在水溶液中羧基通過分子間氫鍵在肽鏈上聚集，形成小簇或大簇。由圖4A1、A2可知，鱈魚皮明膠肽表現(xiàn)出相對均勻均一的顆粒，高度近似100 nm。圖4B1、B2可知，肽硒復合物表現(xiàn)出類似花狀的大小不一的簇狀結(jié)構(gòu)，可能是硒的存在發(fā)生了結(jié)合反應，引起了肽的聚集。與Cui Pengbo等[32]報道肽鈣復合物的結(jié)果類似。

圖4 原子力顯微鏡分析Fig.4 Atomic force microscopic analysis

分別用5 000 倍和30 000 倍的掃描電子顯微鏡觀察鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物，如圖5所示。鱈魚皮明膠肽表現(xiàn)為平整的片狀結(jié)構(gòu)，5 000 倍數(shù)下可以看到凹凸不平的圓弧，這應該是鱈魚皮明膠多肽經(jīng)冷凍干燥后留下的親水區(qū)的痕跡；肽硒復合物比多肽結(jié)構(gòu)更緊密，結(jié)合反應導致大團塊的形成，具有更多的褶皺和晶體結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)的變化表明，鱈魚皮明膠肽與硒離子結(jié)合形成致密的納米顆粒。Sun Na等[17]報道了肽鐵螯合物同樣具有球狀顆粒的褶皺和晶體結(jié)構(gòu)。

圖5 掃描電子顯微鏡分析Fig.5 Scanning electron microscopic analysis

圖6 X射線衍射圖Fig.6 X-ray diffraction patterns

由圖6可知，鱈魚皮明膠多肽在2θ為23°附近出現(xiàn)衍射吸收峰，吸收峰的強度不大，本底較大，說明膠原多肽基本上是無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)。而形成復合物后，X射線衍射圖出現(xiàn)多個強峰和弱峰，圖譜的衍射峰高而尖銳，強度大，說明晶型較好，與孫博[33]的結(jié)論類似。硒的存在增加了鱈魚皮明膠肽硒復合物晶體的結(jié)晶度，說明鱈魚皮明膠肽與硒發(fā)生了反應，生成一種新的物質(zhì)。

2.6 鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合位點分析

如圖7A所示，3 434 cm-1主要由Nü H的伸縮振動所致，1 641 cm-1主要由C＝O的伸縮振動引起，1 454 cm-1主要由ü COO-引起；當多肽與硒離子結(jié)合后，Nü H的吸收峰移動到3 422 cm-1；指紋區(qū)C＝O的吸收峰移動到1 648 cm-1；ü COO-的吸收峰移動到了1 450 cm-1。這與趙立娜等[14]的結(jié)論類似，鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合前后的紅外光譜表明，多肽的氨基和羧基參與了硒離子的配位。

如圖7 B 所示，類似于紅外光譜，鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合也導致了拉曼光譜的變化，3 4 1 4、1 643、1 402 cm-1波數(shù)分別移至3 417、1 633 cm-1和1 402 cm-1。拉曼光譜3 414 cm-1，是由鱈魚皮明膠肽Nü H振動引起，當肽與硒離子結(jié)合后，波峰移動了2 cm-1。約1 643 cm-1的條帶對應酰胺I帶，主要是由于C＝O的伸縮振動，肽硒復合后，移動至1 633 cm-1。鱈魚皮明膠肽的拉曼光譜在1 402 cm-1處的峰值對應于氨基酸側(cè)鏈的COO-官能團的對稱伸縮振動，肽與硒離子結(jié)合后，其峰移動至1 372 cm-1。拉曼光譜進一步驗證了紅外光譜的結(jié)果，鱈魚皮明膠肽的硒結(jié)合位點可能位于羧基和氨基。

圖7 鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合位點分析Fig.7 Analysis of binding sites of hoki skin gelatin peptide with selenium

2.7 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的二級結(jié)構(gòu)分析

圖8 鱈魚皮明膠肽及肽硒復合物的圓二色譜Fig.8 CD spectra of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

由圖8可知，鱈魚皮明膠肽的二級結(jié)構(gòu)主要為β-折疊（28.1%）、無規(guī)卷曲（70.36%），同時含有較少的β-轉(zhuǎn)角（1.57%），當多肽與硒結(jié)合后，新生成了α-螺旋結(jié)構(gòu)，含量為1.1%，β-轉(zhuǎn)角增加至3.3%，β-折疊減少至25.7%，而無規(guī)卷曲無顯著性變化，這與姜丹丹等[34]報道的無規(guī)卷曲基本不受鋅離子影響的結(jié)果類似。結(jié)果表明，鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后，肽鏈的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)變，由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)榱甩?螺旋和β-轉(zhuǎn)角，結(jié)構(gòu)更加有序和緊湊，這與Sun Na等[20]的結(jié)論一致。

3 結(jié) 論

本研究從鱈魚皮中提取明膠，氨基酸分析證明明膠是良好的原料，將酶解后的鱈魚皮明膠多肽與硒離子進行結(jié)合反應，以硒結(jié)合量為指標，篩選出胃蛋白酶為最適酶，其酶解物的平均硒結(jié)合量為13.61 μg/mg。鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后，紫外光譜吸收峰強度增大且紅移，熒光光譜吸收峰由311 nm遷移到355 nm且熒光強度減弱，說明鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合產(chǎn)生新的物質(zhì)；通過激光粒徑儀、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及X射線衍射對其進行微觀結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后粒徑減小，形成更為聚集的簇狀結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)為晶體結(jié)構(gòu)；圓二色譜分析表明鱈魚皮明膠肽上的羧基和氨基可能與硒發(fā)生了結(jié)合反應，使得β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，形成結(jié)構(gòu)更為緊湊的肽硒復合物。本研究為海洋魚皮資源的高值化利用以及新型補硒產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。