郝紫微，戴雨沁，張紹鈴，王 鵬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心，南京 210095）

杜梨（Pyrus betulaefolia）是常用的梨栽培用砧木，具有高度雜合的基因型，遺傳背景復(fù)雜，并且童期長(zhǎng)，因此導(dǎo)致杜梨砧木育種周期極長(zhǎng)［1］。植物基因工程是實(shí)現(xiàn)快速精準(zhǔn)育種的有效方法，而遺傳轉(zhuǎn)化則是其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是目前應(yīng)用最廣泛的方法［2］，農(nóng)桿菌分為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌農(nóng)桿菌中含穿梭質(zhì)粒-Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有可以整合到植物基因組上的T-DNA區(qū)段［3］。目前借助根癌農(nóng)桿菌已成功實(shí)現(xiàn)水稻［4］、玉米［5］、大豆［6］、蘋(píng)果［7］、柑橘［8］等重要作物的遺傳轉(zhuǎn)化。發(fā)根農(nóng)桿菌在感染植物后，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量高度分支的毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒經(jīng)過(guò)改造修飾后，其T-DNA片段區(qū)可以將目標(biāo)基因插入宿主植物的基因組中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根［9］。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所產(chǎn)生的毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、分化程度高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、操作控制簡(jiǎn)單等特點(diǎn)［10］。目前通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在煙草、苜蓿、豌豆、咖啡等植物中獲得了提高抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植株，如抗病、抗蟲(chóng)、耐受重金屬等［10］。此外，近年來(lái)在茶樹(shù)［11，12］、龍眼［13］、枳［14］、山定子［15］和棗樹(shù)［16］等果樹(shù)中也有較多關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳改良和抗病性的研究。梨遺傳轉(zhuǎn)化體系起步較其他物種較晚，目前還缺乏高效快速的遺傳轉(zhuǎn)化方法，嚴(yán)重限制了梨基因功能研究和梨精準(zhǔn)分子育種應(yīng)用［17，18］。本研究以杜梨為研究材料，利用發(fā)根農(nóng)桿菌開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速、高效的杜梨毛狀根轉(zhuǎn)化方法，為梨樹(shù)基因功能研究和遺傳改良提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

杜梨種子經(jīng)4℃沙藏層積35 d后，播種于盆內(nèi)，生長(zhǎng)環(huán)境為光照16 h/黑暗8 h，溫度25±1℃，生長(zhǎng)至6～8片真葉，株高約7 cm時(shí)，用于侵染。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599儲(chǔ)存在含有50%甘油的LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L）中，于-80℃凍存。植物表達(dá)質(zhì)粒載體為pROK2，包含卡那霉素抗性基因篩選標(biāo)記。

1.2 方法

1.2.1 克隆mCherry基因 克隆mCherry熒光蛋白基因（正向引物：5′-acgggggactctagaggatcc ATGGTG AGCAAGGGCGAGG-3′，反 向 引 物 ：5′-gggaaattcg agctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′）并通過(guò)同源重組構(gòu)建到pROK2，mCherry基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為711 bp。采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒，50 μL 總反應(yīng)體積中，包括 5×Phusion GC Buffer 10 μL，10×d NTP Max 1 μL，10μmol/L 正 向 引物 2.5 μL，10 μmol/L 反 向 引物 2.5 μL，模 板 DNA 1 μL，ddH2O 32.5 μL，Phusion DNA Polymerase 0.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：98 ℃30 s，循環(huán)反應(yīng)（30個(gè)循環(huán)）98℃ 10 s→65℃ 30 s→72℃ 45 s，終延伸72℃ 10 min。

1.2.2 產(chǎn)物鑒定及載體構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取約700 bp的目的條帶，用膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。將pROK2空載于37℃下用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切3 h，酶切后膠回收，利用重組酶將基因和酶切好的質(zhì)粒于37℃下反應(yīng)30 min，將重組完畢的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性克隆小量提取質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（運(yùn)用凍融法制備發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)），得到含有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌。

1.2.3 K599發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化 使用凍融法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，方法參照姚丹［19］并作修改。

1）首先將農(nóng)桿菌菌株K599于LB固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL利福平）的平板上劃線(xiàn)，28℃恒溫倒置培養(yǎng)36～48 h。

2）挑取單菌落2～5 mL到LB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL利福平），之后按1%接種率接種于100 mL LB液體（含50 μg/mL利福平）培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8。

3）將菌液分裝于50 mL無(wú)菌離心管中，冰浴10 min，于4℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清。

4）在超凈工作臺(tái)中加入2～5 mL預(yù)冷的10%甘油，吸打混勻后至等體積冰預(yù)冷的10%甘油，4℃、5 000 r/min離心10 min后棄上清。

5）重復(fù)4）步驟1次，然后加入200 μL過(guò)濾除菌的山梨醇（100 mg/mL）重懸。

6）將感受態(tài)細(xì)胞分裝為50 μL/管，液氮速凍后于-80℃保存待用。

7）取500 ng質(zhì)粒加入50 μL融化的農(nóng)桿菌感受態(tài)中，冰上放置30 min；液氮速凍1 min后立即37℃水浴1 min；冰上放置3 min后加入500 μL無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基，28℃、220 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4 h，然后5 000 r/min離心5 min，棄去部分培養(yǎng)基，留100 μL重懸菌體后涂于含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的LB平板上放于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定出來(lái)的陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒再次進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并選擇測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆菌液，在其中加入50%甘油，于-80℃保存。

1.2.4 注射侵染杜梨實(shí)生苗 方法參照Meng等［9］并稍作修改：挑取含有pROK2-35S：mCherry的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599的單克隆在5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素）中，28℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)3～4 h，取1 mL農(nóng)桿菌加到含25 mL LB培養(yǎng)基（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素）的錐形瓶中28℃過(guò)夜培養(yǎng)，OD600值達(dá)到0.3～0.4后，將培養(yǎng)物在室溫下以8 000 r/min離心10 min，然后重懸于MES緩沖液（10 mmol/L MES-KOH，pH 5.2，10 mmol/L MgCl2和 100 μmol/L 乙酰丁香酮），60 r/min室溫緩慢振蕩孵育3 h。將0.1 mL農(nóng)桿菌懸浮液用1 mL注射器注入梨苗距根部1.5 cm位置，然后用脫脂棉沾取少量菌液包裹傷口移入土中。注射后20 d可見(jiàn)愈傷組織在莖的注射部位生長(zhǎng)，注射后45 d可見(jiàn)毛狀根生長(zhǎng)良好。

1.2.5 RNA提取及PCR檢測(cè) 收集毛狀根提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段是長(zhǎng)度為711 bp的mCherry全長(zhǎng)編碼區(qū)，驗(yàn)證載體片段是否插入梨基因組。

1.2.6 注射煙草葉片驗(yàn)證pROK2-35S：mCherry克隆是否可以正常表達(dá) 采用農(nóng)桿菌注射法將pROK2-35S：mCherry載體轉(zhuǎn)入煙草表皮細(xì)胞中，用去掉針頭的注射器將侵染液注入煙草葉片的背面，之后于25℃培養(yǎng)3 d。葉片剪取1 cm2大小制成臨時(shí)裝片，使用Zeiss LSM800激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片在561 nm激發(fā)光下檢測(cè)mCherry表達(dá)情況。

1.2.7 體視顯微鏡觀察杜梨毛狀根中mCherry的熒光 體視熒光顯微鏡可以在不損傷植物的情況下觀察根部熒光。注射后待毛狀根長(zhǎng)出，即可運(yùn)用Leica M205FA體視熒光顯微鏡觀察mCherry的熒光信號(hào)，與未注射的陰性對(duì)照杜梨苗進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 使用侵染煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)目的基因的方法檢測(cè)表達(dá)載體的效率

為了驗(yàn)證pROK2-35S：mCherry表達(dá)載體的效率，利用侵染煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。如圖1所示，注射攜帶pROK2-35S：mCherry農(nóng)桿菌的煙草葉片中有紅色熒光產(chǎn)生，說(shuō)明mCherry可以正常表達(dá)。

2.2 杜梨毛狀根的發(fā)生

取生長(zhǎng)40 d，6～8片葉片的杜梨實(shí)生苗（圖2a），在距根部約1.5 cm的位置（圖2b）注射含pROK2-35S：mCherry質(zhì)粒的農(nóng)桿菌K599，菌液濃度為OD600值0.3～0.4。共注射40株梨苗，18～32 d后愈傷組織出現(xiàn)，產(chǎn)生毛狀根植株為34株，毛狀根產(chǎn)生率為85%，注射后約45 d再生毛狀根生長(zhǎng)良好（圖2c）。轉(zhuǎn)基因毛狀根長(zhǎng)勢(shì)良好且鑒定為陽(yáng)性植株有6株，陽(yáng)性率達(dá)到17.6%。

2.3 毛狀根RT-PCR鑒定

因發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植株自然生長(zhǎng)在土壤中，未經(jīng)過(guò)滅菌處理，通過(guò)DNA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因材料的假陽(yáng)性比例過(guò)高，因此本試驗(yàn)提取毛狀根總RNA進(jìn)行陽(yáng)性植株檢測(cè)。選取生長(zhǎng)良好的杜梨實(shí)生苗轉(zhuǎn)化植株的毛狀根，提取毛狀根總RNA并反轉(zhuǎn)錄。以未侵染的根作為陰性對(duì)照，pROK2-35S：mCherry質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增檢測(cè)mCherry基因，用1%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，34個(gè)產(chǎn)生毛狀根的植株中，有6個(gè)植株及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒均擴(kuò)增出了大小與mCherry基因完全一致的條帶，而陰性對(duì)照植株（CK）則沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。

圖1 煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)pROK2-35S：mCherry載體的表達(dá)效率

圖2 杜梨苗注射部位和毛狀根發(fā)生

圖3 RT-PCR檢測(cè)梨轉(zhuǎn)基因毛狀根中mCherry的表達(dá)

2.4 體視熒光顯微鏡觀察杜梨毛狀根mCherry熒光

為進(jìn)一步確定mCherry在杜梨毛狀根中的表達(dá)，用體視熒光顯微鏡對(duì)梨根部進(jìn)行觀察，結(jié)果可以在根中直接觀察到mCherry的紅色熒光，而在未轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照杜梨根中則無(wú)熒光信號(hào)（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)化的梨毛狀根中可以觀察到mCherry的熒光信號(hào)

3 小結(jié)與討論

本研究探索了杜梨毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，建立了一種通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌直接侵染杜梨產(chǎn)生不定根的方法。侵染時(shí)期為生長(zhǎng)40 d，6～8片葉片的梨實(shí)生苗，注射20 d后，可見(jiàn)不定根在莖的注射部位生長(zhǎng)，注射后45 d可見(jiàn)毛狀根生長(zhǎng)良好，使用該方法可在45 d獲得長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)基因杜梨毛狀根且植株陽(yáng)性率可達(dá)17.6%。結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生是一種不依賴(lài)組織培養(yǎng)的高效轉(zhuǎn)化技術(shù)，也為杜梨基因功能研究提供了新的工具。

目前，果樹(shù)轉(zhuǎn)基因大多依賴(lài)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化已成功在多種果樹(shù)上運(yùn)用，包括蘋(píng)果［20］、山 定 子［21］、葡 萄［22］、草 莓［23］、荔枝［24］、香蕉［25］、柑桔［26］、棗［16］、桃［27］等。梨的轉(zhuǎn)基因研究也普遍采用此方法，以白梨系統(tǒng)的蘋(píng)果梨［28］和鴨梨［29］，砂梨系統(tǒng)的雪青［30］，西洋梨康弗倫斯、帕西和杜康［31，32］以及野生種的杜梨［33］獲得了轉(zhuǎn)基因植株。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法依賴(lài)于組織培養(yǎng)技術(shù)，所受影響因素較多，包括農(nóng)桿菌濃度、適合的侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、成熟的組織培養(yǎng)技術(shù)以及穩(wěn)定高效的再生體系等［33］，這些因素都導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化再生頻率普遍偏低、周期相對(duì)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題［34，35］。

發(fā)根農(nóng)桿菌己成功在多種植物上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，尤其在藥用植物上應(yīng)用廣泛［36-39］。在果樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化研究中，目前只在柑橘［14］和棗樹(shù)［16］上有發(fā)根農(nóng)桿菌通過(guò)外植體侵染的研究報(bào)道。本研究初步建立了直接侵染杜梨實(shí)生苗獲得轉(zhuǎn)基因植株的一個(gè)簡(jiǎn)單而高效的毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，能在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化根。利用該轉(zhuǎn)化方法可以在梨上面開(kāi)展基因功能驗(yàn)證、次生代謝物及植物根系發(fā)育的研究，對(duì)于其他常見(jiàn)果樹(shù)如蘋(píng)果、葡萄等的毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系建立有一定的參考意義。