施 陸, 程 諾, 潘苗苗, 陳 陽(yáng), 張宗申, 劉同祥, 于振艷

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.河南省海樂(lè)森藥用細(xì)胞工程技術(shù)有限公司,河南鄭州 450001)

金鐵鎖多倍體毛狀根的誘導(dǎo)及性質(zhì)

施 陸1, 程 諾1, 潘苗苗1, 陳 陽(yáng)1, 張宗申1, 劉同祥2, 于振艷2

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.河南省海樂(lè)森藥用細(xì)胞工程技術(shù)有限公司,河南鄭州 450001)

研究了秋水仙素對(duì)金鐵鎖毛狀根多倍化、多倍化后毛狀根生長(zhǎng)和皂苷積累的變化。結(jié)果表明,秋水仙素對(duì)金鐵鎖毛狀根的作用效果具有濃度和時(shí)間依賴性,其中,經(jīng)1.25 mmol/L的秋水仙素處理24 h的金鐵鎖毛狀根根尖存活率最高,達(dá)到60%;加倍后細(xì)胞核體積明顯增加,側(cè)根分支比普通毛狀根多,根毛密度也比普通毛狀根大。培養(yǎng)35 d后的生物量是普通毛狀根的1.48倍(干重);多倍體毛狀根和普通毛狀根在皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面差別不大,但在同等培養(yǎng)條件下,多倍體毛狀根的皂苷總產(chǎn)量較高,達(dá)到普通毛狀根的1.45倍。結(jié)果提示,染色體多倍化是一種提高毛狀根質(zhì)量和皂苷產(chǎn)量的潛在重要技術(shù)。

金鐵鎖;毛狀根;多倍體

0 引 言

金鐵鎖(Psammosilene tunicoides)為石竹科金鐵鎖屬多年生藥用植物,主要分布于我國(guó)云南、四川等地區(qū)[1]。金鐵鎖以根入藥,主要用于祛風(fēng)除濕、散瘀止痛,對(duì)抗炎和鎮(zhèn)痛也具有較好作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),金鐵鎖中主要的天然活性成分是三萜、三萜皂苷、內(nèi)酰胺等[3-4]。近年來(lái),金鐵鎖的藥用市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大,其野生資源數(shù)量卻急劇下降,因此采用現(xiàn)代生物技術(shù)解決金鐵鎖藥材短缺問(wèn)題迫在眉睫。毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌所含Ri質(zhì)粒的T-DNA片段在植物細(xì)胞基因組中插入、整合并表達(dá),誘導(dǎo)植物細(xì)胞形成的不定根[5]。毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、無(wú)向地性、激素自養(yǎng)、生理代謝和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),其規(guī)?；囵B(yǎng)是替代野生或大田栽培資源的重要生物技術(shù)手段[6]。

多倍體植物含有3個(gè)以上染色體組,在自然界中普遍存在。與二倍體相比,多倍體植株具有表型巨大、抗逆性強(qiáng)、次級(jí)代謝產(chǎn)物量高等特征[7-9]。在藥用植物育種領(lǐng)域,已經(jīng)有一些關(guān)于多倍體藥用植株育種研究文獻(xiàn)報(bào)告,但在離體器官水平上多倍化的研究還很少[10-11]。本研究通過(guò)秋水仙素浸漬的方式,使毛狀根的細(xì)胞于減數(shù)分裂期抑制紡錘體生成,阻止染色體分離,使得植物細(xì)胞染色體加倍,從而獲得多倍體毛狀根,并獲得相應(yīng)多倍體的有利性狀,達(dá)到相同培養(yǎng)條件下次生代謝物產(chǎn)量得以增加的目的,以期為后續(xù)通過(guò)規(guī)模化培養(yǎng)多倍體毛狀根生產(chǎn)天然產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

懸浮培養(yǎng)的金鐵鎖毛狀根根尖,大連工業(yè)大學(xué)藥用植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供;秋水仙素, Sigma公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品,上海江萊生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 秋水仙素濃度和處理時(shí)間的確定

以金鐵鎖毛狀根的根尖作為原材料。將金鐵鎖毛狀根根尖切下,長(zhǎng)度為0.5 cm,分別用不同濃度的秋水仙素溶液浸泡處理。每組濃度的秋水仙素處理設(shè)置10瓶重復(fù),每瓶接入50段根尖,在溫度(24±1)℃、轉(zhuǎn)速110 r/min的條件下于搖床上暗培養(yǎng),并分別統(tǒng)計(jì)和計(jì)算培養(yǎng)24、48和72 h后毛狀根的存活率。

1.2.2 染色體染色與觀察

取材:將毛狀根轉(zhuǎn)移到新鮮MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d后,切取1～2 mm的根尖待用。毛狀根根尖的處理、染色以及制片等按照劉永安等[12]的方法進(jìn)行。在光學(xué)顯微鏡(CX31 RTSF)下觀察。

1.2.3 毛狀根形態(tài)學(xué)的觀察

將經(jīng)過(guò)不同濃度秋水仙素處理24 h的毛狀根用無(wú)菌水沖洗,轉(zhuǎn)接至1/2 MS液態(tài)培養(yǎng)基中, (24±1)℃黑暗條件下在轉(zhuǎn)速為110 r/min搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)35 d后,將多倍體毛狀根與培養(yǎng)35 d的普通毛狀根進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比,觀察其粗細(xì)、長(zhǎng)短、分支多少等,采用Canon D60相機(jī)拍照。

1.2.4 毛狀根生長(zhǎng)量的測(cè)定

將40個(gè)100 m L三角瓶平均分為4組,分別加入約20 m L的1/2 MS液體培養(yǎng)基,稱初始總質(zhì)量,分別接入1 g的普通毛狀根和1.25、2.50和5.00 mmol/L 3種濃度秋水仙素分別處理24 h的毛狀根,于相同條件下培養(yǎng)。每7 d測(cè)定一次總質(zhì)量,減去各自的初始總質(zhì)量,為毛狀根的生物量。每組取10瓶的平均值,記錄、分析秋水仙素對(duì)毛狀根生長(zhǎng)量的影響。

1.2.5 毛狀根皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

目前,國(guó)內(nèi)尚無(wú)金鐵鎖皂苷類成分的法定對(duì)照品,本實(shí)驗(yàn)選用齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品,采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定金鐵鎖總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

金鐵鎖毛狀根總皂苷提取、測(cè)定以及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等按照Z(yǔ)hang等[13]方法進(jìn)行。

1.2.6 金鐵鎖毛狀根活力的檢測(cè)

采用FDA法檢測(cè)金鐵鎖毛狀根活力的活力。在樣品中滴加0.12 mol/L的FDA溶液,在25℃孵育20 min,抽濾除去孵育液,用1/2 MS液體培養(yǎng)基反復(fù)沖洗幾次,直到?jīng)_洗液無(wú)顏色后于倒置熒光顯微鏡(Motic AE31)下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理濃度和時(shí)間對(duì)金鐵鎖毛狀根活力的影響

由圖1可知,毛狀根的存活率與秋水仙素處理濃度和處理時(shí)間都有很大關(guān)系,具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性。在相同處理時(shí)間的條件下,秋水仙素濃度越低,毛狀根的存活率越高;隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),毛狀根存活率急劇下降,到72 h時(shí),毛狀根幾乎全部死亡。從圖1中可以看出,經(jīng)0.75 mmol/L的秋水仙素處理毛狀根根尖24 h,毛狀根的存活率最高,達(dá)到76%;經(jīng)1.25 mmol/L的秋水仙素處理毛狀根根尖24 h,毛狀根的存活率較高,達(dá)到62%。

圖1 秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖毛狀根存活率的影響Fig.1 Effects of colchicine concentrations and treatment time on the survival rates of hairy roots

如圖2所示并結(jié)合圖1結(jié)果,確定經(jīng)過(guò)0.75、1.25 mmol/L的秋水仙素處理24 h的毛狀根均具有較高存活率和較強(qiáng)的根活力。

圖2 毛狀根的活力染色結(jié)果Fig.2 The vitality of hairy roots after dyeing

2.2 多倍體毛狀根的染色體觀察

分別將經(jīng)過(guò)0.75和1.25 mmol/L秋水仙素處理24 h的毛狀根根尖培養(yǎng)一段時(shí)間,觀察染色體并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)量,結(jié)果如圖3所示。圖3表明,金鐵鎖毛狀根普通體細(xì)胞中染色體n=14,即2n=28;經(jīng)過(guò)0.75 mmol/L秋水仙素處理的毛狀根細(xì)胞中染色體數(shù)與普通毛狀根染色體數(shù)相同,細(xì)胞核體積與普通細(xì)胞核相差不大;而經(jīng)過(guò)1.25 mmol/L秋水仙素處理的毛狀根細(xì)胞中染色體數(shù)明顯多于普通毛狀根細(xì)胞染色體數(shù),并且細(xì)胞核體積明顯增大;這說(shuō)明秋水仙素的濃度過(guò)低不利于進(jìn)行多倍體誘導(dǎo),因此選擇1.25 mmol/L的秋水仙素處理毛狀根根尖24 h進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。在保證成功誘導(dǎo)多倍體毛狀根的前提下,毛狀根的存活率處于最高水平并具有較強(qiáng)活力。

2.3 多倍體毛狀根的形態(tài)比較

2.3.1 多倍體毛狀根與普通毛狀根分支的比較

將毛狀根用秋水仙素處理24 h后進(jìn)行培養(yǎng), 35 d后取樣觀察側(cè)根和根毛,結(jié)果如圖4所示。普通毛狀根與多倍體毛狀根的形態(tài)區(qū)別主要體現(xiàn)在側(cè)根分枝和根毛兩部分:秋水仙素處理的毛狀根,側(cè)根分支明顯比普通毛狀根多,可以達(dá)到三級(jí)側(cè)根,而普通毛狀根主要是二級(jí)側(cè)根;染色體加倍毛狀根的根毛分布密度大,長(zhǎng)度更長(zhǎng);3種濃度秋水仙素處理結(jié)果相比,1.25 mmol/L的秋水仙素處理的效果最好。根毛密集更有利于毛狀根對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收,在一定程度上促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)。

2.3.2 多倍體毛狀根與普通毛狀根生物量的比較

圖3 不同濃度秋水仙素處理毛狀根根尖細(xì)胞中的染色體Fig.3 Chromosomes of hairy roots treated by different concentrations of colchicine

經(jīng)過(guò)秋水仙素處理24 h,將毛狀根培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定生長(zhǎng)量變化,結(jié)果如圖5所示。與普通毛狀根相比,相同條件下多倍體毛狀根在一定程度上生物量增長(zhǎng)更快。這可能是植物細(xì)胞經(jīng)加倍處理后,細(xì)胞體積巨大化、細(xì)胞分裂周期縮短、細(xì)胞數(shù)量增加所引起的。對(duì)比發(fā)現(xiàn),秋水仙素處理濃度對(duì)毛狀根生長(zhǎng)量也有很大影響,濃度為1.25 mmol/L的效果最好。原因可能有兩個(gè),一是不同秋水仙素濃度處理的毛狀根其多倍體的雜合比例不同,以及多倍體的分裂周期不同,導(dǎo)致其生長(zhǎng)變化的速度也相應(yīng)不同;二是不同濃度秋水仙素處理的毛狀根對(duì)毛狀根本身造成的潛在傷害也不同,從而導(dǎo)致其生長(zhǎng)速率不同,但是具體的影響需要進(jìn)一步研究。

圖6為秋水仙素處理的毛狀根在懸浮條件下培養(yǎng)35 d后的生長(zhǎng)狀態(tài),具體生物量在表1中列出。結(jié)果表明,3種濃度秋水仙素處理的毛狀根,除了生物量有差異,各自的生長(zhǎng)狀態(tài)正常,如色澤乳白、分支多、沿培養(yǎng)基水平生長(zhǎng)等特征;秋水仙素處理的毛狀根生物量都超過(guò)普通毛狀根,其中1.25 mmol/L秋水仙素處理的毛狀根生物量增加最多,35 d后毛狀根干重是普通毛狀根的1.48倍。2.3.3 多倍體毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

以7 d為取樣周期,分別測(cè)定毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見圖7。結(jié)果表明,在培養(yǎng)的14 d內(nèi),多倍體毛狀根與普通毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別甚微,并且維持不變,14 d以后才逐漸增加;多倍體毛狀根中的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)時(shí)間比普通毛狀根皂苷更滯后,可能是經(jīng)秋水仙素處理的毛狀根生長(zhǎng)周期更長(zhǎng),導(dǎo)致次級(jí)代謝變化時(shí)間滯后,這是典型的半生長(zhǎng)偶聯(lián)型次級(jí)代謝類型[14]。

圖4 不同濃度秋水仙素處理多倍體毛狀根與普通毛狀根的分支比較Fig.4 Comparison of branches of polyploid and common hairy roots treated by different concentrations of colchicine

圖5 不同濃度秋水仙素對(duì)毛狀根生長(zhǎng)量的影響Fig.5 The effects of different concentrations of colchicine on the growth of hairy roots

圖6 多倍體毛狀根經(jīng)不同濃度的秋水仙素處理35 d后的生長(zhǎng)情況Fig.6 The growth of polyploid hairy roots treated by different concentrations of colchicine for 35 d

表1 不同濃度秋水仙素處理后毛狀根干重的變化Tab.1 The changes of dry weight of hairy roots treated by different concentrations of colchicine

圖7 不同濃度秋水仙素對(duì)毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 The effects of different concentrations of colchicine on saponins contents in hairy roots

將培養(yǎng)35 d的毛狀根烘干至恒重后,分別稱取1 g樣品測(cè)定皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù),并據(jù)此計(jì)算皂苷總產(chǎn)量。皂苷總產(chǎn)量=皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×毛狀根生物量,結(jié)果如表2所示。

表2 不同濃度秋水仙素處理后毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及皂苷總產(chǎn)量Tab.2 The saponin contents in hairy root and total saponin yields treated by different concentrations of colchicine

結(jié)果表明,不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)的多倍體毛狀根其毛狀根中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,但差別不大。研究表明,藥用植物細(xì)胞染色體多倍化后,細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物積累的能力提高[15]。結(jié)果提示,毛狀根細(xì)胞染色體加倍后,皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)并沒有顯著變化,該結(jié)果證明了植物次生代謝的復(fù)雜性,具有種質(zhì)、細(xì)胞生理階段、器官等特異性,當(dāng)然也可能與毛狀根本身的生長(zhǎng)特點(diǎn)有關(guān)。盡管皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大,但秋水仙素處理的毛狀根生物量增加明顯,所以皂苷總產(chǎn)量比普通毛狀根增加很多,特別是經(jīng)1.25 mmol/L秋水仙素處理24 h的毛狀根,其皂苷總產(chǎn)量是普通毛狀根的1.45倍。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的秋水仙素對(duì)金鐵鎖毛狀根進(jìn)行多倍體誘導(dǎo),同時(shí)對(duì)多倍體毛狀根的生長(zhǎng)量、皂苷產(chǎn)量以及生長(zhǎng)形態(tài)進(jìn)行研究。結(jié)果表明,金鐵鎖毛狀根根尖經(jīng)1.25 mmol/L的秋水仙素處理24 h,毛狀根成功加倍,且存活率處于最高水平。金鐵鎖毛狀根多倍化后側(cè)根分枝增加,根毛密度和長(zhǎng)度變化很大;這有利于毛狀根生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素和水分的吸收,使多倍體金鐵鎖毛狀根在單位時(shí)間內(nèi)生物量大幅提高,盡管皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大,但皂苷總產(chǎn)量明顯增加。結(jié)果提示,毛狀根細(xì)胞染色體多倍化是改善毛狀根生物量和提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方式。

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Induction and characterization of hairy roots-derived polyploidy of Psammosilene tunicoides

SHI Lu1, CHENG Nuo1, PAN Miaomiao1, CHEN Yang1, ZHANG Zongshen1, LIU Tongxiang2, YU Zhenyan2

(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Henan Health Medicinal Cell Engineering and Technology Limited Company,Zhengzhou 450001,China)

The effects of colchicine on polyploidisation of Psammosilene tunicoides hairy roots and changes in both growth of hairy roots and saponins contents were studied.The results showed that the effects of colchicine were in a time and concentration dependent manner,and the maximum survival rate was up to 60%treated by 1.25 mmol/L colchicine for 24 h.The nuclear volume was significantly increased treated by 2.5 mmol/L colchicine,and the colchicine-treated hairy roots had more lateral roots branch and higher roots hair density compared with the normal.The biomass(dry weight)of the treated hairy roots was 1.48 times of that of ordinary hairy roots after cultured for 35 d.The saponin contents of the two types of hairy roots had little differences,but the saponins yield of the treated hairy roots was 1.45 times of that of normal hairy roots under the same culture conditions.The results suggested that polyploidisation of chromosome would be a potential method to improve the efficiency and quality of hairy roots in large scale culture in the future.

Psammosilene tunicoides;hairy roots;polyploidy

S567.2

A

1674-1404(2017)01-0014-05

2015-12-11.

河南省科技創(chuàng)新杰出人才項(xiàng)目(134200510002).

施陸(1991-),女,碩士研究生;通信作者:張宗申(1968-),男,教授.

施陸,程諾,潘苗苗,陳陽(yáng),張宗申,劉同祥,于振艷.金鐵鎖多倍體毛狀根的誘導(dǎo)及性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36 (1):14-18.

SHI Lu,CHENG Nuo,PAN Miaomiao,CHEN Yang,ZHANG Zongshen,LIU Tongxiang,YU Zhenyan.Induction and characterization of hairy roots-derived polyploidy of Psammosilene tunicoides[J].Journal of Dalian Polytechnic University,2017,36(1):14-18.