何含杰，施和平

1 中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004

2 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631

三裂葉野葛Pueraria phaseoloides，系豆科多年生藤本植物，其根含有葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物，具有改善心腦血循環(huán)、降低血脂與血糖、增強(qiáng)免疫力等功能及具有類似雌性激素的功效，廣泛用于治療高血壓、冠心病、心絞痛等病癥[1-2]。但由于其野生資源的匱乏以及人工栽培的時(shí)效性差而無(wú)法滿足醫(yī)藥工業(yè)的巨大需求。為此，我們?cè)煤吧蚏i質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834對(duì)三裂葉野葛葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了能在無(wú)激素 MS培養(yǎng)基上自主快速生長(zhǎng)及能產(chǎn)生較高含量葛根素的毛狀根[3]。已有的研究結(jié)果表明，植物毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝物質(zhì)的合成與積累易受到培養(yǎng)基類型、植物激素等諸多因素的影響[4-7]。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素參與和調(diào)控了植物許多重要的生理過(guò)程，如器官的發(fā)育與衰老、藥用植物的生長(zhǎng)和次生代謝以及基因的表達(dá)調(diào)控等[8-11]。如在供試的培養(yǎng)基中添加不同的外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可以促進(jìn)雪蓮Saussurea involucrata毛狀根和亞麻 Linum album毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝物的生物合成與積累[4,12]。但迄今為止未見(jiàn)有關(guān)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)和異黃酮含量影響的報(bào)道。本文報(bào)道細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)和異黃酮化合物含量的影響，旨在為運(yùn)用植物激素來(lái)調(diào)節(jié)三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)和葛根素等異黃酮類物質(zhì)的合成與積累奠定實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所采用的材料是由含野生農(nóng)桿堿型 Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834遺傳轉(zhuǎn)化三裂葉野葛葉片外植體所產(chǎn)生的毛狀根，其誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)方法見(jiàn)已發(fā)表方法[3]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

采用的培養(yǎng)基為添加不同濃度 6-BA或6-BA＋2.0 mg/L NAA組合的固體MS培養(yǎng)基，其中6-BA濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、3.0和5.0 mg/L，每個(gè)150 mL錐形瓶中分裝40 mL培養(yǎng)基。滅菌前pH值調(diào)至5.8?6.0，經(jīng)121 ℃、20 min高溫濕熱滅菌后待用。接種后，毛狀根置于培養(yǎng)架上，于 (25±2)℃暗培養(yǎng)。

1.3 三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)及其生物量測(cè)定

選取生長(zhǎng)旺盛的三裂葉野葛毛狀根，用無(wú)菌水洗去培養(yǎng)基后，剪切成4?5 cm且具根尖的根段，按約0.5 g/瓶接入含植物激素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔5 d隨機(jī)抽取毛狀根培養(yǎng)物各 3瓶，用自來(lái)水洗去培養(yǎng)物上的培養(yǎng)基，并用吸水紙吸干水分后測(cè)定毛狀根的鮮重和干重。一部分毛狀根培養(yǎng)物于–80 ℃超低溫冰箱中保存，供測(cè)定其可溶性蛋白含量和保護(hù)酶活性及提取植物基因組DNA；另一部分毛狀根在恒溫烘箱中60 ℃烘干后，供測(cè)定其異黃酮化合物含量。

1.4 三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物中異黃酮化合物含量的測(cè)定

三裂葉野葛毛狀根中異黃酮化合物含量的測(cè)定，參照我們已發(fā)表的方法[3]。

1.5 毛狀根培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量、SOD和POD活性的測(cè)定

三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量的測(cè)定參照 Bradford的方法。用考馬斯亮藍(lán)G-250對(duì)制備好的酶液進(jìn)行染色，搖勻后于島津UV-1206型紫外光/可見(jiàn)光分光光度儀上 (595 nm)測(cè)定其光吸收值 (OD)，同時(shí)以制備提取液所用的磷酸緩沖液作為空白對(duì)照[13]。SOD活性的測(cè)定參照 Beauchamp和 Fridovich的方法進(jìn)行操作，以抑制NBT光還原50%所需要的酶量為一個(gè)酶活性單位，酶活性以 U/mg蛋白表示[14]。POD活性的測(cè)定參照已發(fā)表的方法[15]。

1.6 毛狀根基因組DNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

三裂葉野葛毛狀根基因組DNA的提取，參照文獻(xiàn)[3]。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條件是：1%瓊脂糖，1×50 TEB，50 V，1.5 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)的影響

無(wú)激素MS培養(yǎng)基 (對(duì)照)培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)至25 d時(shí)其干重達(dá)到最大，約為1.47 g DW/瓶；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，毛狀根逐漸褐化，其生物量也開(kāi)始下降 (圖1 A)。與對(duì)照相比，細(xì)胞分裂素6-BA明顯抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，降低其生物量，且此抑制作用與6-BA濃度呈正相關(guān)；培養(yǎng)至30 d時(shí)，添加6-BA培養(yǎng)基培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根的干重雖達(dá)到最大值，但僅為同期對(duì)照生物量的26.3%?47.8% (圖1 A)；其中低濃度0.1 mg/L 6-BA可以抑制毛狀根側(cè)根的產(chǎn)生，促進(jìn)老根的褐化與衰老；而5.0 mg/L 6-BA則完全抑制毛狀根的生長(zhǎng)，老根逐漸變成黑色或逐漸膨大且似愈傷化 (圖1 B、C、D)，表明6-BA可抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，降低毛狀根的生物量。

2.2 6-BA對(duì)三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響

圖1 6-BA或6-BA和NAA結(jié)合對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of 6-BA or in combination with NAA on the growth of P. phaseoloides hairy roots. (A)Effect of 6-BA on the biomass of P. phaseoloides hairy roots. (B), (C), (D)Treatment with 6-BA. (E), (F), (G)Treatment with 6-BA and NAA 2.0 mg/L combination, the 6-BA concentrations was 0 mg/L in (B), 0.1 mg/L in (C)and (E), 1.0 mg/L in (F), 5.0 mg/L in (D)and (G)(15 d).

圖2為6-BA濃度對(duì)三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響。從圖 2可見(jiàn)，對(duì)照毛狀根培養(yǎng)物中異黃酮化合物呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，培養(yǎng)至10 d時(shí)，毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物含量達(dá)到最高，約為32.22 mg/g DW(圖2 A)。與對(duì)照相比，培養(yǎng)至25 d時(shí)，細(xì)胞分裂素6-BA 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L和5.0 mg/L處理的毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物含量分別是對(duì)照含量的1.2、1.7、1.8、1.7和1.7倍 (圖2 A)。然而，細(xì)胞分裂素6-BA卻降低每個(gè)培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物的含量；培養(yǎng)至30 d時(shí)，培養(yǎng)瓶中總異黃酮化合物的含量是同期對(duì)照含量的47.8%?68.6% (圖2 B)。這表明6-BA可降低每個(gè)培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量。

2.3 6-BA和NAA結(jié)合對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)的影響

從圖3可見(jiàn)，對(duì)照三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)至20 d時(shí)其干物質(zhì)量達(dá)到最大值，約為1.0 g DW/瓶，是培養(yǎng)初期的10.1倍 (圖3A)。而6-BA 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的毛狀根則生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)至25 d時(shí)其干物質(zhì)量達(dá)到最大值，其干重分別比起始培養(yǎng)時(shí)增加了6.1、5.6、5.3、4.8和 4.6倍，但僅為同期對(duì)照毛狀根生物量的83.7%、78.0%、74.5%、68.4%和66.4% (圖3)。培養(yǎng)5 d后，低濃度6-BA (0.1 mg/L和1.0 mg/L)和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根的老根 (起始根端)上長(zhǎng)出許多粗短的側(cè)根，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多；培養(yǎng)20 d后毛狀根從白色變?yōu)辄S色 (圖1E、F)。相反，高濃度的6-BA 5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L結(jié)合則抑制毛狀根的生長(zhǎng)，其起始根段逐漸褐化和膨大(圖 1G)。與對(duì)照相比，6-BA和 NAA 2.0 mg/L結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，且其抑制作用與6-BA的濃度成正比 (圖3)。表明細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，且NAA具有協(xié)同作用。

圖2 6-BA對(duì)三裂葉野葛毛狀根異黃酮含量的影響Fig. 2 Effects of 6-BA on the contents of isoflavones in P. phaseoloides hairy roots. (A)Isoflavones contents per gram in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots. (B)Total isoflavones contents per flask in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots.

2.4 6-BA和 NAA結(jié)合對(duì)毛狀根中異黃酮化合物含量的影響

圖3 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of 6-BA and NAA on the growth of P. phaseoloides hairy roots.

圖4 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響Fig. 4 Effects of 6-BA and NAA on the contents of isoflavones in P. phaseoloides hairy roots. (A)Isoflavones contents per gram in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots. (B)Total isoflavones contents per flask in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots.

圖4為6-BA和NAA結(jié)合對(duì)三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響。從圖 4可見(jiàn)，培養(yǎng)至25 d時(shí)，對(duì)照毛狀根培養(yǎng)物的異黃酮化合物含量達(dá)到最大值，約19.76 mg/g DW (圖4 A)。與對(duì)照相比，不同濃度6-BA和NAA 2.0 mg/L結(jié)合則可促進(jìn)毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物的積累，且其促進(jìn)作用隨著 6-BA濃度的增加而愈加顯著；培養(yǎng)至20 d時(shí)，6-BA和NAA組合處理的毛狀根異黃酮化合物含量是同期對(duì)照含量的96.9%?131.7% (圖4 A)。但若以每瓶異黃酮含量計(jì)，6-BA和NAA組合處理則降低每個(gè)培養(yǎng)瓶的毛狀根總異黃酮化合物的含量，培養(yǎng)至25 d時(shí)，其總異黃酮化合物含量約為同期對(duì)照含量的 74.8%?89.6% (圖 4 B)。這表明，6-BA和NAA組合不僅抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，而且降低每個(gè)培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量。

2.5 6-BA和 NAA結(jié)合對(duì)三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白含量的影響

圖5為6-BA和NAA結(jié)合對(duì)毛狀根中可溶性蛋白含量的影響。從圖 5可見(jiàn)，對(duì)照三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，培養(yǎng)至25 d時(shí)其含量比起始水平下降約37.9%。與對(duì)照相比，6-BA 0.1、0.5、1.0、3.0或5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L組合處理的毛狀根培養(yǎng)物的可溶性蛋白含量在培養(yǎng)至15 d時(shí)到達(dá)最大值，且分別比對(duì)照提高49.5%、47.5%、30.2%、52.6%和46.5%；隨后其可溶性蛋白含量開(kāi)始逐漸下降；培養(yǎng)至25 d時(shí)達(dá)到最低值，但其含量均比同期對(duì)照高 (圖 5)。該結(jié)果表明，6-BA和NAA可以提高三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白的含量，推測(cè)其可能與毛狀根的生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。

2.6 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根SOD活性的影響

圖6為6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根SOD活性的影響。從圖6可見(jiàn)，對(duì)照三裂葉野葛毛狀根中SOD的活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，培養(yǎng)至25 d時(shí)達(dá)到最大值，是培養(yǎng)初期 SOD活性的 1.6倍。與對(duì)照相比，培養(yǎng)15 d時(shí)，6-BA和NAA結(jié)合處理的毛狀根SOD活性達(dá)到最低值 (P＜0.01)，隨后又開(kāi)始逐漸升高；培養(yǎng)至 25 d時(shí)，不同濃度 6-BA和 NAA 2.0 mg/L結(jié)合處理的毛狀根SOD活性分別是其培養(yǎng)初期的1.5、1.9、1.9、1.5和1.8倍，但僅是同期對(duì)照SOD活性的82.9%、89.5%、82.0%、69.0%和78.6% (圖6)?？梢?jiàn)在0?25 d培養(yǎng)期間，6-BA和NAA結(jié)合處理的毛狀根SOD活性都低于同期對(duì)照，這表明，6-BA和NAA結(jié)合可以降低三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物的SOD活性。

圖5 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根中可溶性蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of 6-BA and NAA on the contents of soluble protein in P. phaseoloides hairy roots.

2.7 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響

圖7為6-BA和NAA結(jié)合對(duì)三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響。從圖7可見(jiàn)，不同濃度6-BA和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根POD活性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，且均高于對(duì)照活性水平。培養(yǎng)至25 d時(shí)，其POD活性達(dá)到最大值，6-BA 0.1、0.5、1.0、3.0、5.0和NAA 2.0 mg/L組合培養(yǎng)的毛狀根培養(yǎng)物POD活性比培養(yǎng)5 d時(shí)分別增加了2.8、4.6、3.0、4.5和3.2倍，分別是同期對(duì)照活性水平的1.3、1.9、1.6、1.7 和 1.3 倍 (P＜0.05)(圖 7)。這說(shuō)明6-BA和NAA可以提高三裂葉野葛毛狀根的POD活性，且其活性水平與毛狀根生長(zhǎng)受抑制程度和培養(yǎng)時(shí)間成正比。

2.8 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根PCD的影響

圖6 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根中SOD活性的影響Fig. 6 Effects of 6-BA and NAA on the activities of SOD in P. phaseoloides hairy roots.

圖7 6-BA和NAA對(duì)三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響Fig. 7 Effects of 6-BA and NAA on the activities of POD in P. phaseoloides hairy roots.

圖8 6-BA和NAA處理后三裂葉野葛毛狀根中DNA片段的電泳檢測(cè)Fig. 8 Electrophoresis detection of DNA fragments in P. phaseoloides hairy roots under 6-BA and NAA treatment.(A)Detection of DNA fragments in P. phaseoloides hairy roots under 6-BA treatment alone. (B)Treatment with 6-BA and NAA 2.0 mg/L combination, the 6-BA concentrations was same in (A)and (B). M: marker; 1: 6-BA 0 mg/L; 2:6-BA 0.1 mg/L; 3: 6-BA 0.5 mg/L; 4: 6-BA 1.0 mg/L; 5: 6-BA 3.0 mg/L; 6: 6-BA 5.0 mg/L.

圖8為6-BA或6-BA和NAA結(jié)合處理對(duì)三裂葉野葛毛狀根PCD發(fā)生的影響。由圖8可見(jiàn)，6-BA處理的三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)至30 d時(shí)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)到140?200 bp大小的 DNA ladder，說(shuō)明 6-BA可以誘導(dǎo)三裂葉野葛毛狀根 PCD的發(fā)生 (圖 8 A)。而 6-BA和 NAA結(jié)合處理的三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)至20 d時(shí)，可以檢測(cè)到DNA ladder，而培養(yǎng)至25 d時(shí)，其DNA ladder更加明顯，這說(shuō)明6-BA和NAA可以誘導(dǎo)三裂葉野葛毛狀根PCD的發(fā)生，且NAA具有協(xié)同作用 (圖8 B)。

3 討論

已有的研究表明，毛狀根的生長(zhǎng)及其次生代謝物質(zhì)的合成受到植物激素等因素的影響，但其影響程度因植物激素種類的不同而異[16]。NAA和IAA可顯著地促進(jìn)人參Panax ginseng毛狀根的生長(zhǎng)，而低濃度6-BA則可促進(jìn)人參皂苷的合成和積累[17]。而NAA 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L結(jié)合則抑制酸漿果Physalis minima毛狀根的生長(zhǎng)，促進(jìn)其毛狀根培養(yǎng)物中澳洲茄胺的合成與積累，其含量約是對(duì)照含量的 3.6倍[18]。2,4-D可以強(qiáng)烈抑制何首烏Polygonum multiflorum毛狀根的生長(zhǎng)和蒽醌類化合物的合成，而適量濃度的NAA和6-BA結(jié)合則可促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)以及蒽醌類化合物的生物合成[8]。然而，在培養(yǎng)黃芩Scutellaria baicalensis毛狀根時(shí)觀察到，NAA可同時(shí)促進(jìn)黃芩毛狀根的生長(zhǎng)和黃芩苷的合成；而6-BA則只抑制黃芩毛狀根的生長(zhǎng)，但有利于黃芩苷的合成和積累[19]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NAA 0.5 mg/L則可以明顯提高紫雪花 Plumbago indica毛狀根培養(yǎng)物中磯松素的含量，但2,4-D則明顯抑制紫雪花毛狀根的生長(zhǎng)和磯松素的合成與積累[20]。此外，KT 0.5 mg/L可以促進(jìn)蕪菁Brassica rapa毛狀根中芥子油苷的積累，而對(duì)白芥Sinapis alba毛狀根次生代謝物的含量無(wú)明顯影響；但是，2,4-D (0.4 mg/L)不僅促進(jìn)上述兩種毛狀根的生長(zhǎng)，而且降低毛狀根培養(yǎng)物中芥子油苷的含量[21]。這表明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)及其藥用成分合成與積累的調(diào)控作用可因植物種類和植物激素種類的不同而有所差異。在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的6-BA或6-BA和NAA結(jié)合均抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，此抑制作用與6-BA的濃度成正相關(guān)，且NAA具有協(xié)同作用 (圖1、3)。雖然6-BA或6-BA和NAA結(jié)合可以促進(jìn)三裂葉野葛毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物的合成與積累，但是降低每個(gè)培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量(10%?26%)(圖2、4)。這表明6-BA或6-BA和NAA結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，降低其毛狀根干物質(zhì)量和總異黃酮化合物含量，這與Putalun等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[18]。

植物在受到傷害和逆境脅迫后，將開(kāi)啟自身的防御機(jī)制，如提高SOD、POD等保護(hù)酶的活性水平，同時(shí)將體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)成分轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，調(diào)整體內(nèi)ROS含量至基準(zhǔn)水平而發(fā)揮保護(hù)作用[22]。在培養(yǎng)黃瓜 Cucumis sativus毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA可以延緩毛狀根中可溶性蛋白含量的下降，降低毛狀根SOD和POD活性水平，減少其內(nèi)源性乙烯的釋放量，從而調(diào)節(jié)毛狀根的生長(zhǎng)和衰老[23]。外施6-BA能有效阻止棉花 Gossypium spp.葉片內(nèi)可溶性蛋白含量的迅速下降，提高葉片內(nèi)SOD活性水平，并延緩棉花幼苗的衰老[24]。與對(duì)照相比，6-BA和NAA結(jié)合提高三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白的含量和POD活性水平，降低其體內(nèi)的SOD活性水平，這與 Shi等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致 (圖 5、6、7)[23]。我們推測(cè)，這種差異可能與植物種類及毛狀根類型有關(guān)。

PCD是植物生長(zhǎng)過(guò)程中一種重要的生理現(xiàn)象，并可受到許多因素的誘導(dǎo)和影響，如植物激素等[25-26]。高濃度激動(dòng)素 KT (2.0 mg/L或4.0 mg/L KT)處理棉花懸浮細(xì)胞4 d后，不僅出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，而且可以檢測(cè)到 140?180 bp及其倍增的DNA ladder[27]。外施6-BA可以促進(jìn)煙草 Nicotiana tabacum和胡蘿卜 Daucus carota細(xì)胞的衰老，誘導(dǎo)細(xì)胞PCD的發(fā)生，提高衰老相關(guān)基因 (Senescence-associated genes,SAG)SAG-12基因的表達(dá)水平，促進(jìn)DNA ladder的形成[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源6-BA或6-BA和 NAA結(jié)合不僅抑制三裂葉野葛毛狀根的生長(zhǎng)，而且促進(jìn)毛狀根的衰老 (圖1、3)。外源6-BA或 6-BA和 NAA結(jié)合處理三裂葉野葛毛狀根20?30 d后，在毛狀根基因組DNA中均可以檢測(cè)到 140?200 bp或倍增的 DNA ladder，其中6-BA和NAA結(jié)合誘導(dǎo)的DNA ladder出現(xiàn)時(shí)間比6-BA單獨(dú)誘導(dǎo)的出現(xiàn)時(shí)間提前約10 d (圖8)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，6-BA或6-BA和NAA均可以促進(jìn)三裂葉野葛毛狀根 PCD的發(fā)生，而且NAA在6-BA誘導(dǎo)的PCD過(guò)程中具有協(xié)同作用。

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，最終是對(duì)靶基因和功能蛋白質(zhì)表達(dá)水平的調(diào)控[29]。利用植物激素處理大豆 Glycine max細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素均抑制饑餓相關(guān)基因 (Starvation-associated messages,SAMs)SAM22/26/46的表達(dá)，誘導(dǎo)S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的上調(diào)表達(dá)，但二者結(jié)合使用時(shí)則無(wú)誘導(dǎo)效果[30]。細(xì)胞分裂素可通過(guò)受體蛋白CRE1/AHK4感知和應(yīng)答其信號(hào)，然后通過(guò)多級(jí)磷酸化作用向下游傳遞信號(hào)，并最終誘導(dǎo)擬南芥培養(yǎng)細(xì)胞PCD的發(fā)生[26,31]。而在煙草細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，外源生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)激素響應(yīng)基因pLS216在轉(zhuǎn)錄水平的短暫積累，而細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)效果則較生長(zhǎng)素遲緩，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[32]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA或6-BA和NAA結(jié)合不僅誘導(dǎo)三裂葉野葛毛狀根PCD的發(fā)生，而且NAA具有協(xié)同作用，但二者調(diào)控毛狀根的生長(zhǎng)、異黃酮化合物的代謝、PCD發(fā)生及相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制則尚不清楚，待今后進(jìn)一步研究。

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