祁靜，劉濤，李珍，貢成良，吳海蘋，張春

1 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所 蘇州市分子診斷與治療技術重點實驗室，江蘇 蘇州 215163

2 蘇州大學基礎醫(yī)學與生命科學學院，江蘇 蘇州 215006

3 廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，福建 廈門 361022

內(nèi)毒素又稱之“熱原”，其主要成分為脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)。熱原進入人體內(nèi)后可導致發(fā)熱、休克甚至死亡，因而內(nèi)毒素檢測是藥廠制藥和醫(yī)療設備制造中必須的一道程序[1-2]。鱟試劑 (Limulus Amebocyte Lysate,LAL/Tachypleus Amebocyte Lysate, TAL)是國際上至今為止檢測內(nèi)毒素的金標準，具有簡單、快速、靈敏度高等特點。然而鱟數(shù)量有限，鱟血中 G因子干擾以及鱟試劑批次間不均一性等局限性，迫切需要開發(fā)鱟試劑的替代品[3-5]。

鱟C因子 (Factor C)是鱟血細胞中對LPS具有高親和力的一種絲氨酸蛋白酶，LPS激活Factor C后，活化的C因子能起始鱟血細胞中的凝集反應，并且其絲氨酸酶活性可以切割含精氨酸 (Arg)的三肽底物[6-7]。早期有研究人員在不同的表達系統(tǒng)中表達過鱟C因子，并證實該蛋白在昆蟲細胞中表達時具有完全的生物學功能[8-11]。

桿狀病毒表達系統(tǒng)具有高效表達，安全性好，表達產(chǎn)物穩(wěn)定，后加工修飾等優(yōu)點[12]，與細菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)并列為公認的基因工程 4大表達系統(tǒng)[13]。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (Autographa califormica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)和家蠶桿狀病毒 (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是最常用的兩類桿狀病毒表達載體。前者利用無血清培養(yǎng)基在昆蟲細胞中表達蛋白，可用于生產(chǎn)和純化分泌蛋白[14-15]。后者利用家蠶生物反應器表達重組蛋白，相比前者具有表達產(chǎn)量高、成本低、易形成自主產(chǎn)業(yè)等特點[16-18]。Wang等[11]利用AcNPV在草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda 卵巢細胞系Sf9細胞中表達Factor C，可用于檢測內(nèi)毒素，其反應原理如圖1所示。

圖1 重組Factor C檢測內(nèi)毒素原理圖Fig. 1 Endotoxin detection mechanism of recombinant Factor C.

Bac-to-Bac/BmNPV桿狀病毒表達系統(tǒng)是2005年由 Motohashi等[19]首次建立的，相比傳統(tǒng)的BmNPV表達系統(tǒng)，生產(chǎn)重組蛋白的周期大大縮短[20]。本研究利用該系統(tǒng)表達鱟C因子，并分析表達產(chǎn)物的生物學活性，旨在為開發(fā)低成本新型內(nèi)毒素檢測試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和細胞

pFastBacHTb載體、大腸桿菌 (E. coli)DH5α由本實驗室保存。E. coli BmDH10Bac[21]、家蠶細胞系 BmN和家蠶品種青松×皓月由蘇州大學基礎醫(yī)學與生命科學學院貢成良實驗室保存。東方鱟血細胞由廈門鱟試劑廠饋贈。

1.1.2 試劑和酶

RT逆轉錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。KOD-plus-neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司。Trizol試劑、Grace細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、cellfectinⅡReagent均購自Gibco公司。熒光底物購自 Sigma公司。引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組pFastbacHTb-Factor C載體的構建

用 trizol試劑提取東方鱟血細胞中的總RNA, 逆轉錄成cDNA。設計一對特異性引物擴增factor C基因片段 (P1和P2，見表1)。并且在上下游引物 5′末端分別引入 XbaⅠ和 KpnⅠ酶切位點。PCR擴增條件為94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，59.5 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖電泳，膠回收。用 XbaⅠ和 KpnⅠ雙酶切膠回收產(chǎn)物和pFastbacHTb載體，純化后用T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態(tài)，挑取轉化子經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。

1.2.2 重組bacmid-Factor C的構建

將測序正確的pFastbacHTb-Factor C質(zhì)粒轉化含有bacmid和helper質(zhì)粒的BmDH10Bac感受態(tài)，藍白斑篩選出陽性克隆，抽提重組bacmid，用M13通用引物PCR鑒定 (P3和P4，見表1)。

1.2.3 重組桿狀病毒的獲取

將鑒定正確的bacmid-Factor C用cellfectinⅡReagent轉染六孔板中的BmN細胞，細胞密度為60%–70%，120 h后收集培養(yǎng)上清，1 000 r/min離心5 min，得到的上清即為P1。取P1按MOI值0.1連續(xù)感染BMN細胞兩次后獲得高滴度的P3病毒。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 桿狀病毒表達Factor C的鑒定

取MOI 1、5、10感染六孔板中的BMN細胞，48、72 h后收集細胞，1 000 r/min離心，用無內(nèi)毒素水洗兩遍。細胞沉淀裂解后，上清用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。濃度膠濃度 5%，分離膠濃度 10%。一抗為小鼠抗6×His單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的抗體。

1.2.5 重組Factor C在家蠶幼蟲中的表達

參照Yue等[22]報道的方法，2 μL P3野生型(Wild)病毒和重組 Factor C病毒 (108pfu/mL)皮下注射到五齡第 1天家蠶體內(nèi)，當家蠶出現(xiàn)典型的病變特征后每天收集家蠶血清，4 000 r/min、4 ℃離心 5 min，上清凍于–20 ℃。

1.2.6 重組Factor C的活性鑒定

參照Ding等[23]報道的方法，家蠶血清用無內(nèi)毒素水稀釋100、500、1 000倍，利用動態(tài)熒光法檢測重組Factor C活性。在無內(nèi)毒素的96孔板中依次加入LPS (0–10 EU/mL)，0.01%吐溫20，稀釋的蠶血，75 μmol/L熒光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA，總體積 200 μL。設定酶標儀的反應溫度為37 ℃，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長460 nm，檢測熒光信號。每個濃度做3個復孔，設置陰性對照2個。

2 結果

2.1 重組pFastbacHTb-Factor C載體的構建

圖2 Factor C基因的克隆和pFastbacHTb-Factor C的構建Fig. 2 Cloning of factor C and construction of pFastbacHTb-Factor C. (A)RT-PCR cloning of factor C. M: DNA marker DS 5 000; 1: PCR fragment of factor C. (B)Identification of pFastbacHTb-Factor C by restrictive enzyme digestion. M: DNA marker DS 5 000; 1: pFastbacHTb-factor C digested with XbaⅠ/Kpn I.

東方鱟factor C基因全長3 060 bp，編碼1 019個氨基酸。以逆轉錄的cDNA為PCR模板擴增目的基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示目的基因的大小在3 000 bp附近 (圖2A)。factor C基因通過XbaⅠ和KpnⅠ插入到pFastbacHTb載體中，轉化后抽提質(zhì)粒雙酶切鑒定，可切下4.8 kb和3 kb左右預期大小的條帶 (圖2B)。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測序，與GenBank中已報道的東方鱟factor C基因序列 (D90271)比對，顯示僅僅編碼的第 823個氨基酸不一樣，但與同一亞科的圓尾鱟 factor C基因序列該位點的氨基酸一致 (S77063)，說明得到的基因序列是正確的。

2.2 重組bacmid-Factor C的鑒定

以野生型bacmid和重組bacmid-Factor C為模板，M13上下游引物做PCR擴增，鑒定重組桿狀病毒 DNA。結果顯示，野生型 bacmid在250 bp附近有目的條帶(圖3A)，與預期的300 bp一致。重組bacmid在5 000–6 000 bp之間有目的條帶 (圖3B)，與預計的5 500 bp結果一致。

2.3 重組桿狀病毒的獲取

圖3 PCR鑒定重組bacimdFig. 3 Identification of recombinant bacmid by PCR.(A)M: DNA marker DS 5 000; 1: wild bacmid. (B)M:1 kb DNA marker; 1: recombinant bacmid.

重組bacmid轉染BmN細胞后，72 h后可以觀察到明顯的病變，表現(xiàn)在細胞停止生長，形狀由梭形變成圓形。120 h大部分細胞飄起來，并裂解 (圖 4)。此時可以收集到成熟的桿狀毒P1。

2.4 重組Factor C在BmN細胞中的表達

用抗his標簽的單克隆抗體檢測BmN細胞中表達的重組Factor C，同時用未感染的BmN細胞和野生型病毒感染的BmN細胞作對照。結果顯示，相比對照，重組病毒感染的BmN細胞在100 kDa處有預期大小的條帶 (圖5)。

圖4 正常細胞和bacmid轉染后的細胞Fig. 4 Normal BMN and BMN cells transfected with bacmid. (A)Normal BMN cells. (B)BMN cells transfected with recombinant bacmid after 120 h.

圖5 抗 His標簽單抗對重組 rFC的 Western blotting檢測Fig. 5 Identification of rFC expressed in BmN cells by Western blotting using anti-his-tag antibody. M:PageRuler TM prestained protein ladder; 1: normal BmN cells; 2: BmN cells infected by wild virus; 3: BmN cells infected with recombinant virus.

2.5 重組Factor C在家蠶幼蟲中的表達

桿狀病毒注射到家蠶幼蟲后，72 h后家蠶出現(xiàn)典型的感染癥狀，即食欲下降，生長緩慢,并出現(xiàn)身體腫脹，關節(jié)處最為明顯 (圖6)。144 h后感染的家蠶幼蟲陸續(xù)開始死亡。收集72、96、120、144 h的家蠶血清，用于后續(xù)Factor C的活性測定。

2.6 重組Factor C的活性鑒定

圖6 正常家蠶幼蟲和病毒感染后的家蠶幼蟲Fig. 6 Normal silkworm larvae and infected silkworm larvae. (A)Normal silkworm larvae. (B)Silkworm larvae infected by recombinant virus after 72 h.

取病毒感染的家蠶血清稀釋 100、500、1 000倍，測定其中Factor C的活性。結果顯示5 d時收集的蠶血稀釋500倍時檢測的信噪比較高,且靈敏度較高 (表 2)。取病毒感染 5 d后的家蠶血清做500倍稀釋，內(nèi)毒素梯度為0.2、0.5、1、2、5、10 EU/mL，動態(tài)熒光法檢測Factor C活性。結果顯示，隨著內(nèi)毒素濃度的增加以及反應時間的延長，檢測到的熒光信號增強(圖7A)。以內(nèi)毒素濃度和熒光強度做標準曲線，R2值為0.997，因而表達的重組Factor C可以用來檢測內(nèi)毒素，且靈敏度達到了 0.2 EU/mL(圖 7B)。

3 討論

重組鱟C因子具有LPS結合活性和絲氨酸蛋白酶活性，因而可作為新型內(nèi)毒素檢測試劑，解決鱟數(shù)量有限，鱟血中G因子旁路干擾[24]，鱟試劑各批次不穩(wěn)定性的缺點。早期有研究者在細菌，酵母中表達重組 C因子，均不能得到有絲氨酸酶活性的蛋白,后證實該重組蛋白在昆蟲細胞中表達后具有完整的生物學活性[11]。昆蟲表達系統(tǒng)具有容量大、周期短、表達量高、翻譯后加工等優(yōu)點。Ding等[25]在昆蟲細胞 sf9中表達了重組C因子，用培養(yǎng)上清檢測內(nèi)毒素，靈敏度可到0.01 EU/mL，達到了高靈敏度的鱟試劑檢測水平 (0.06–0.015 EU/mL)。但利用該方法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)試劑，需要無血清，懸浮培養(yǎng)大量細胞，成本較高。Usami等[26]比較了多種重組蛋白在昆蟲細胞 sf9和家蠶幼蟲中的表達水平，結果顯示，家蠶幼蟲中重組蛋白的表達量比細胞表達量平均高達70倍。此外，利用家蠶為宿主，相比昆蟲細胞具有成本低，易形成自主產(chǎn)業(yè)等優(yōu)勢。

表2 病毒感染家蠶幼蟲不同時間點后 C因子相對活性的比較Table 2 Relative activity of Factor C at different times after infection by virus

圖7 重組Factor C的活性檢測Fig. 7 Activity detection of recombinant Factor C. (A)Dynamic curve of endotoxin detection. (B)Standard curve of endotoxin detection.

本研究通過RT-PCR獲得了東方鱟的factor C基因序列，利用Bac-to-Bac/BmNPV表達系統(tǒng)，首次在家蠶幼蟲中表達了重組Factor C，并用動態(tài)熒光法檢測到了Factor C的活性。由于家蠶血清中的某些絲氨酸蛋白酶也能非特異切割熒光底物，產(chǎn)生熒光信號，對血清進行稀釋能降低干擾。研究顯示，病毒感染的家蠶血清稀釋100、500、1 000倍時均能夠檢測到重組Factor C的活性。其中，稀釋 500倍時檢測的信噪比較高，且具有較高靈敏度，表明了重組 Factor C在家蠶幼蟲中有較高的表達。Factor C表達載體的N端帶有6個組氨酸 (his)，用重組病毒感染BmN細胞和家蠶幼蟲，用抗 his-標簽的抗體對細胞裂解液和血清做Western blotting分析。前者能檢測到 100 kDa的目的帶，后者未能檢測到his標簽，推測重組Factor C在家蠶幼蟲中表達時N端的his標簽隨信號肽一起被切除后，蛋白分泌到血清中。由于環(huán)境中內(nèi)毒素的存在，以及稀釋倍數(shù)較高，表達的重組Factor C對LPS的靈敏度目前只能到0.2 EU/mL，但仍達到了普通鱟試劑的檢測水平(0.5–0.125 EU/mL)。如何有效降低家蠶血清中的干擾，以及獲得更高的檢測靈敏度，還需要進一步的研究。本研究為開發(fā)低成本新型內(nèi)毒素檢測試劑奠定了基礎。

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