曾麗丹， 陳容欽， 李曉云， 李 玲

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

研究表明，組蛋白去乙?；改苷{(diào)控植物根系生長[1]. 利用組蛋白去乙?；敢种苿㎞aB(Sodium Butyrate)處理玉米阻遏根分生組織細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致玉米根生長受到抑制[1]. 用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA(Trichostatin A)處理slr-1突變體能夠重新誘導(dǎo)側(cè)根形成，說明HDAC抑制側(cè)根形成[2]. 水稻中的組蛋白去乙?；窸sHDAC1降低OsNAC6啟動(dòng)子相關(guān)部位的乙?；?，促進(jìn)水稻主根生長[3]. 組蛋白去乙酰化酶對(duì)根生長具有調(diào)控作用，且調(diào)控機(jī)制與生長素、基因表達(dá)和細(xì)胞分裂相關(guān).

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根不會(huì)產(chǎn)生嵌合體且具有獨(dú)特性，是比較理想的遺傳材料[4-5]. 利用發(fā)根農(nóng)桿菌把外源基因?qū)胫参锼拗鞣椒ㄓ兄苯咏臃N法、外植體接種法和原生質(zhì)體共培養(yǎng)法，其中外植體接種法應(yīng)用較廣，這種方法主要以植物的子葉、下胚軸、幼嫩的莖等部位作為外植體，將其浸泡在活化的發(fā)根農(nóng)桿菌液中，經(jīng)過共培養(yǎng)、抗性篩選得到無菌毛狀根[6]. 本文以花生葉片為外植體，通過外植體接種法獲得AhHDA1轉(zhuǎn)基因花生毛狀根.

AhHDA1是從花生葉片中克隆得到的組蛋白去乙?；富颍捌谘芯拷Y(jié)果表明該基因轉(zhuǎn)入擬南芥中異源表達(dá)后抑制了細(xì)胞分裂相關(guān)基因AtCYCD1、AtE2Fb和生長素輸出相關(guān)基因AtPIN1、AtPIN2的表達(dá)水平，影響了生長素極性運(yùn)輸,改變生長素在根部的積累和分布，從而影響分生區(qū)細(xì)胞分裂和伸長區(qū)細(xì)胞伸長，進(jìn)而抑制擬南芥主根生長和側(cè)根形成[7]. 本實(shí)驗(yàn)將表達(dá)載體35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1分別轉(zhuǎn)入不同的花生毛狀根中獲得AhHDA1轉(zhuǎn)基因毛狀根，發(fā)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)基因毛狀根側(cè)根生長狀況存在差異，故推測(cè)AhHDA1影響花生毛狀根側(cè)根生長. 本文研究AhHDA1對(duì)花生毛狀根側(cè)根生長的影響及機(jī)制，進(jìn)一步了解AhHDA1對(duì)根系生長的調(diào)控作用.

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

選取飽滿的花生粵油7號(hào)種子浸泡過夜，次日轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，萌發(fā)期間隔天換1次水. 種子萌發(fā)后，播種于盛有泥炭土的圓形花盆中. 培養(yǎng)至二葉期，取葉片作為基因轉(zhuǎn)化的外植體.

1.2 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化花生

分別取帶有35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi、35S∷AhHDA1-eGFP載體的K599重組菌進(jìn)行活化，然后將菌擴(kuò)大培養(yǎng)至A600達(dá)到0.6. 參照蘇良辰[8]的方法，對(duì)花生葉片進(jìn)行表面消毒，切斷葉脈,在重組菌液中浸泡15 min，葉片轉(zhuǎn)至1/2MS(加頭孢霉素和硫酸卡那霉素)培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)獲得毛狀根.

1.3 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

取生長旺盛的花生毛狀根(約30天)200 mg，參照Trizol RNA試劑盒(購買自TaKaRa Bio Inc.)說明書提取根部總RNA，采用5X All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒[購買自Applied Biological Materials (abm) Inc.]合成cDNA，以cDNA為模板使用Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀(購買自美國Bio-Rad)檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量. 擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[9]，檢測(cè)所用引物見表1.

1.4 核蛋白提取

取生長至旺盛期的花生毛狀根500 mg，參照劉星[10]的方法提取核蛋白.

1.5 蛋白表達(dá)檢測(cè)

提取的核蛋白參照SU等[11]的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過轉(zhuǎn)膜、孵化、顯影等步驟檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因毛狀根中AhHDA1的蛋白表達(dá)水平. 一抗為anti-AhHDA1，二抗為兔抗(購至鼎國生物公司).

1.6 啟動(dòng)子活性分析

參照張拜宏[12]的方法獲得含以pGreen載體為骨架的pAhIAA28∷LUC和pAhCYCD4∷LUC載體的重組菌. 按質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒. 參考劉星[10]的方法提取擬南芥原生質(zhì)體，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，參考Promega Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，收集原生質(zhì)體并使用多功能酶標(biāo)儀(購至PerkinElmer)測(cè)定(發(fā)射峰560 nm)響應(yīng)載體的原生質(zhì)體細(xì)胞的熒光淬滅值與內(nèi)參進(jìn)行比較，計(jì)算所得本載體的LUC值.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因AhHDA1毛狀根中AhHDA1的基因和蛋白表達(dá)

利用發(fā)根農(nóng)桿菌將35S∷eGFP(對(duì)照，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1表達(dá)載體導(dǎo)入花生葉片，通過培養(yǎng)獲得AhHDA1轉(zhuǎn)基因毛狀根. 取出生長旺盛時(shí)期的毛狀根，鑒定3種轉(zhuǎn)基因毛狀根中AhHDA1的表達(dá)水平，結(jié)果表明：35S∷AhHDA1-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中AhHDA1的相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，其AhHDA1的轉(zhuǎn)錄水平只有對(duì)照的60%，而35S∷AhHDA1毛狀根中AhHDA1的相對(duì)表達(dá)水平是對(duì)照的77.8倍.

圖2結(jié)果顯示，在35S∷eGFP轉(zhuǎn)基因毛狀根中檢測(cè)不到AhHDA1蛋白表達(dá)，而在35S∷AhHDA1毛狀根中AhHDA1的蛋白表達(dá)水平較高，說明AhHDA1轉(zhuǎn)入毛狀根中并正常表達(dá).

圖2 35S∷eGFP和35S∷AhHDA1毛狀根AhHDA1的蛋白表達(dá)水平

2.2 AhHDA1的過表達(dá)對(duì)花生毛狀根的影響

在3種轉(zhuǎn)基因毛狀根中，均出現(xiàn)側(cè)根長和側(cè)根短2種不同的表型(圖3)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，35S∷AhHDA1-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中側(cè)根長的毛狀根所占比例為31.7%(圖3A)，高于對(duì)照組(17.5%)和35S∷AhHDA1轉(zhuǎn)基因毛狀根(18.2%). 在35S∷AhHDA1轉(zhuǎn)基因毛狀根中側(cè)根短的毛狀根占39.4%(圖3B)，高于對(duì)照的15.0%和35S∷AhHDA1-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根的2.4%. 說明AhHDA1在花生毛狀根中超表達(dá)后可能抑制了毛狀根側(cè)根生長.

圖3 不同表型的毛狀根在不同基因型花生毛狀根中的百分比

2.3 AhHDA1對(duì)毛狀根AhCYCD4和AhIAA28的表達(dá)及啟動(dòng)子活性的影響

CYCD4編碼D型細(xì)胞周期蛋白，研究表明CYCD4能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂潛能，使中柱細(xì)胞轉(zhuǎn)變成中柱起始細(xì)胞，從而影響側(cè)根原基形成；IAA28是AUX/IAA基因家族的成員，編碼生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期應(yīng)答因子. 基因AhCYCD4和AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中的表達(dá)水平被顯著下調(diào)(圖4)，而在35S∷AhHDA1毛狀根中這2個(gè)基因的表達(dá)水平皆被顯著上調(diào). 說明AhHDA1調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因AhCYCD4和生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AhIAA28的表達(dá).

圖4 AhHDA1對(duì)AhCYCD4和AhIAA28表達(dá)水平的調(diào)控

分別克隆獲得AhCYCD4和AhIAA28啟動(dòng)子上游約2 000 bp的序列，皆含有啟動(dòng)子活性調(diào)控、脅迫應(yīng)答和光合作用相關(guān)的功能元件. AhHDA1顯著激活A(yù)hCYCD4和AhIAA28啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(圖5)，說明AhHDA1直接調(diào)控基因AhCYCD4和AhIAA28.

圖5 AhHDA1對(duì)AhCYCD4和AhIAA28啟動(dòng)子活性的調(diào)控

2.4 轉(zhuǎn)AhHDA1毛狀根中AhARF19和AhIAA28的表達(dá)

檢測(cè)ARF19在轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果所示(圖6)，AhIAA28和AhARF19基因在35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1毛狀根中的相對(duì)表達(dá)水平不同，其中AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中的表達(dá)被抑制，而在35S∷AhHDA1毛狀根中的表達(dá)水平被上調(diào)；而AhARF19在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中表達(dá)水平被上調(diào)，在35S∷AhHDA1毛狀根中表達(dá)被抑制，推測(cè)AhARF19是AhIAA28的下游基因，AhIAA28可能抑制AhARF19的表達(dá)，從而抑制毛狀根側(cè)根生長.

圖6 AhIAA28和AhARF19在轉(zhuǎn)AhHDA1毛狀根中的表達(dá)水平

3 討論

根的發(fā)育可塑性對(duì)于維持植物的生存和生長來說非常重要[13-14]，根的構(gòu)型和生長主要與根分生組織的細(xì)胞分裂活性相關(guān)，與伸長區(qū)細(xì)胞的長度有關(guān). CYCD4是D型細(xì)胞周期蛋白，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂潛能，使中柱細(xì)胞轉(zhuǎn)變成中柱起始細(xì)胞，從而影響側(cè)根原基形成，擬南芥CYCD4功能缺陷后，中柱細(xì)胞分裂速率減弱導(dǎo)致植株的側(cè)根密度減小[15]. 本文的研究結(jié)果表明，AhCYCD4在花生的35S∷AhHDA1毛狀根中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在表型上與對(duì)照組相比，35S∷AhHDA1毛狀根側(cè)根的生長被抑制，側(cè)根數(shù)量沒有影響，推測(cè)AhCYCD4高水平表達(dá)可能誘導(dǎo)中柱細(xì)胞分裂，促進(jìn)35S∷AhHDA1毛狀根側(cè)根原基形成，由于側(cè)根原基的分裂、生長過程中可能受到其他因素的影響，使其難以形成側(cè)根.

IAA28是AUX/IAAs家族成員，為生長素信號(hào)中的負(fù)調(diào)控因子，在響應(yīng)生長素時(shí)發(fā)生泛素化降解使生長素信號(hào)繼續(xù)傳遞. 超表達(dá)IAA28的擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)量減少，而iaa28突變體植株的側(cè)根數(shù)是Col的2～3倍，說明IAA28在側(cè)根的形成過程中起抑制作用[16]. 本文結(jié)果顯示：超表達(dá)AhHDA1的花生毛狀根與對(duì)照組相比，其側(cè)根的生長被抑制，且AhIAA28在35S∷AhHDA1毛狀根中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明AhIAA28表達(dá)上調(diào)后可能抑制了毛狀根側(cè)根生長，相關(guān)文獻(xiàn)只提出IAA28抑制側(cè)根形成，沒有涉及對(duì)側(cè)根生長的影響，我們推測(cè)有另一個(gè)基因，AhIAA28通過調(diào)控這個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控毛狀根側(cè)根生長.

ARFs位于AUX/IAAs的下游，生長素含量較低時(shí)AUX/IAAs結(jié)合ARFs并抑制其活性. ARFs的B3結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合生長素應(yīng)答基因啟動(dòng)子上的生長素響應(yīng)元件(AuxRE)，從而影響這些基因的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)控側(cè)根發(fā)育過程起重要作用[17].arf7arf19雙突變體的側(cè)根形成被完全抑制；ARF2、ARF3、ARF4等RNA受干擾后抑制側(cè)根生長[18-20]. 推測(cè)AhHDA1調(diào)控靶基因AhIAA28的表達(dá)水平后，可能影響AhIAA28的下游基因ARFs的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控毛狀根側(cè)根生長. 檢測(cè)AhHDA1超表達(dá)毛狀根中AhARF19的相對(duì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，AhHDA1超表達(dá)抑制了AhARF19的表達(dá)水平，符合超表達(dá)AhHDA1抑制花生毛狀根側(cè)根生長的表型.AhHDA1在花生毛狀根中超表達(dá)后顯著上調(diào)了AhIAA28的表達(dá)水平，同時(shí)顯著抑制了AhARF19的表達(dá)，35S∷AhHDA1毛狀根的側(cè)根生長受抑制，推測(cè)AhARF19很可能是AhIAA28的下游基因. 因此，AhHDA1對(duì)花生毛狀根側(cè)根生長的調(diào)控機(jī)制可能是：AhHDA1激活A(yù)hCYCD4和AhIAA28啟動(dòng)子的活性，從而上調(diào)這2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，AhIAA28表達(dá)上調(diào)后抑制了其下游基因AhARF19的相對(duì)表達(dá)水平，從而抑制花生毛狀根側(cè)根生長. 關(guān)于AhARF19和AhIAA28與毛狀根側(cè)根生長之間的關(guān)系，兩者是否通過生長素AUX/IAA-ARF信號(hào)途徑作用，需要進(jìn)一步分析AhHDA1毛狀根中AhIAA28的蛋白含量以及AhARF19的蛋白活性.