閆少凱，李育成，林景春要愛琴杜玄，溫玉梅

(張家口市第二醫(yī)院 1.CT室，2.骨科，3.急診科，4.檢驗科，5.內(nèi)二科，河北張家口 075000)

椎間盤真空征是影像學概念，表現(xiàn)為椎間盤線性或類圓形密度缺失影[1-2]。椎間盤真空征指椎間盤退變形成低壓力的空腔，導致周圍組織產(chǎn)生的氣體通過裂隙進入空腔，該征象是椎間盤退變的典型征象。既往研究多關(guān)注椎間盤真空征的形成機制、原因和影像學特點，少有關(guān)注其遺傳易感性。生長分化因子5(growth differentiate factor5，GDF5)在軟骨形態(tài)發(fā)生及關(guān)節(jié)形成中有重要作用[3]，被證實具有促進椎間盤組織修復[4]、間充質(zhì)細胞集結(jié)、Ⅱ型膠原蛋白基因表達等作用[5]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)疾病與GDF5基因單核酸多態(tài)性之間存在密切關(guān)聯(lián)[6-7]。但少有GDF5基因多態(tài)性與椎間盤真空征的相關(guān)研究，鑒于此，本研究篩選退變性腰椎滑脫癥患者為樣本，選取rs143383位點檢測GDF5基因多態(tài)性，通過統(tǒng)計學分析探討GDF5 rs143383位點基因多態(tài)性是否為椎間盤真空征的易感因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究已經(jīng)獲得張家口市第二醫(yī)院倫理機構(gòu)批準，連續(xù)性選擇2017年1月～2018年1月就診的206腰椎滑脫癥患者為研究對象，所有患者張家口市市區(qū)及周邊地區(qū)居民，均知情同意本研究并簽署同意書。納入標準：①經(jīng)MRI或CT證實為腰椎退變性滑脫癥；②有完整的影像學及臨床資料；③漢族，年齡>18周歲。排除標準：①崩裂性滑脫、椎管腫瘤、強直性脊柱炎、脊髓感染等；②既往有手術(shù)或創(chuàng)傷史；③多節(jié)段病變。根據(jù)CT椎間盤真空現(xiàn)象評估標準[8](脊柱矢狀位見一個或多個線性密度缺失影，軸位見類圓形的密度缺失影)，將患者分為真空征組和非真空征組。

1.2 GDF5基因多態(tài)性檢測

1.2.1 靜脈血全基因組DNA提取

采集患者禁食水12 h外周靜脈血3 mL置于2% EDTA抗凝試管中，取100 μL樣本，加入紅細胞裂解液混勻，冰浴15 min，4℃離心3 min，棄上清，加入5% Chelez 100 200 μL充分混勻，56℃孵育20 min，震蕩10 s，離心2 min，取上清儲存于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取DNA液60 μL，應(yīng)用AU1001核酸提取儀及配套試劑(北京百泰克公司)提取DNA，以Tris-HC1做空白對照，UV7500雙光束紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)鑒定DNA純度和完整性，取吸光度(A260/280 nm)值在1.6-1.8，濃度>50 ng/μL的 DNA 樣品待檢。

1.2.2 基因多態(tài)性分型

GenBank數(shù)據(jù)庫查找基因GDF5基因，Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物合成由上海天昊公司完成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含有60 ng DNA，2.5 μL dNTPs(2 mmol/L)，PCR擴增反應(yīng)條件：94℃ 預變性5 min，94℃變性30 s, 55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。取出擴增產(chǎn)物25 μL，4℃保存，瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)R-250電泳儀(上海復日公司) 掃描并拍照。采用iMLDR法，取上述PCR擴增產(chǎn)物10 μL，使用美國應(yīng)用生物公司(ABI)開發(fā)的SNaPshot技術(shù)進行GDF5 rs143383位點基因多態(tài)性測定。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SHEsis軟件對GDF5 rs143383位點基因進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P>0.05為符合遺傳平衡吻合度。真空征組與非真空征組的組間、男女之間基因型頻率、等位基因頻率分布差異采用x2檢驗，采用Logistic回歸分析處理GDF5 rs143383位點基因多態(tài)性與退變性腰椎滑脫癥伴椎間盤真空征的相關(guān)性。所有統(tǒng)計均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

206例患者中，真空征組39例，非真空征組167例，真空征組年齡大于非真空征組(P<0.05)，椎間盤真空征患者的家族史比例高于非真空征組(P<0.05)。兩組性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、工作類型、臨床表現(xiàn)、Meyerding分級、腰椎外傷史、隨訪時間比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基線資料比較

2.2 GDF5 rs143383基因多態(tài)性與椎間盤真空征發(fā)生的相關(guān)性

206例患者GDF5 rs143383基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.569、0.531，均>0.05)，具有群體代表性，可進行遺傳學分析。真空征組與非真空征組的基因頻率分布、等位基因頻率差異顯著(P<0.05)，顯性模型(TTVSTC+CC)比較差異顯著(2=9.068，P=0.003，OR=1.535，95%CI：1.382-1.689)，隱性模型(TT+TCVSCC)比較無統(tǒng)計學差異(2=1.586，P=0.208，OR=0.539，95%CI：0.485-1.021)，見表2。

表2 GDF5 rs143383基因頻率分布的組間差異[例(%)]

2.3 不同性別之間GDF5 rs143383基因多態(tài)性

女性GDF5 rs143383基因頻率分布、等位基因頻率與男性差異明顯(P<0.05)，顯性模型(TTVSTC+CC)比較差異顯著(2=9.754，P=0.002，OR=1.035，95%CI：1.002-1.139)，隱性模型(TT+TCVSCC)比較無差異(2=1.074，P=0.300，OR=0.531，95%CI：0.478-1.009)，見表3。

2.4 腰椎滑脫癥患者發(fā)生椎間盤真空征的風險因素分析

以是否患有椎間盤真空征為因變量(0=否，1=是)，建立多元Logistic回歸模型，以年齡(連續(xù)性變量)、性別(賦值：1=男，2=女)、椎間盤真空征家族史(賦值：0=無，1=有)、BMI(連續(xù)性變量)、工作類型(賦值：1=腦力，1=體力)、Meyerding分級(賦值：1= I度，2= II度，3=Ⅲ度)、腰椎外傷史(賦值：0=無，1=有)、GDF5基因多態(tài)性(賦值：1=TT基因型，2=TC基因型，3=CC基因型)為應(yīng)變量，結(jié)果顯示：年齡、工作類型、椎間盤真空征家族史、GDF5基因多態(tài)性與椎間盤真空征的發(fā)生獨立相關(guān)，見表4。進一步校正年齡、性別等混雜因素影響，rs143383位點攜帶TC基因型個體發(fā)生椎間盤真空征的風險較低(OR=0.603，95%CI：0.264-0.952，P=0.021)，攜帶TT基因型個體發(fā)生椎間盤真空征的風險明顯增高(OR=1.725，95%CI：1.261-4.990，P=0.000)。

表4 椎間盤真空征的Logistic分析結(jié)果

3 討論

脊柱真空征指發(fā)生在椎體、椎間盤、關(guān)節(jié)間隙以及椎管內(nèi)的氣體積聚現(xiàn)象，常人椎間盤真空征發(fā)生率為1.0%～3.0%，椎間盤真空征的發(fā)生與脊柱退行性病變密切相關(guān)，約20.0%的老年腰腿痛患者中可檢出椎間盤真空征[9]。退變性腰椎滑脫是臨床常見的退變性腰椎疾病，此類患者椎間盤真空征的發(fā)生率較高，達10.40%，真空征可導致椎間隙塌陷，并導致滑脫椎體手術(shù)復位效果失敗[10]。退變性腰椎滑脫癥患者椎間隙前凸角度、高度丟失，導致周圍韌帶松弛，活動幅度加大，進而加速椎間盤、周圍韌帶、肌肉和椎小關(guān)節(jié)的勞損性退變，對抗椎體前移的力量降低。隨著年齡的增長、脊椎的退變性發(fā)展，髓核中水分的不斷丟失，椎間盤局部出現(xiàn)裂隙，應(yīng)力分布發(fā)生改變，導致椎間隙塌陷和椎體滑脫繼續(xù)進展。發(fā)展到退變性滑脫中晚期，椎間盤裂隙逐漸增大，周圍組織產(chǎn)生的氣體通過裂隙不斷進入空腔，形成椎間盤真空征[11-12]。

脊椎退變性疾病被證實與多種基因多態(tài)性有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的具有多態(tài)性的相關(guān)基因有維生素D受體[13]、金屬基質(zhì)蛋白酶[14]、白介素[15]等。GDF5是促進軟骨發(fā)育、形成的成骨蛋白，主要表達于軟骨細胞聚集期、軟骨核以及關(guān)節(jié)形成區(qū)域，主要通過Cx43介導的縫隙連接細胞間信號通路調(diào)節(jié)、促使間充質(zhì)細胞聚集向軟骨方向分化，具有調(diào)控骨骼發(fā)育和關(guān)節(jié)形成的作用。Walsh等[16]采用GDF5基因治療退變性腰椎間盤疾病，發(fā)現(xiàn)治療后椎間盤纖維軟骨細胞數(shù)量明顯增加，蛋白多糖及II型膠原mRNA表達活躍，提示GDF5具有修復椎間盤的作用。GDF5基因突變可導致常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為先天軟骨發(fā)育不良。GDF5基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)病有著密切的聯(lián)系，現(xiàn)有研究顯示GDF5基因多態(tài)性與成人女性身高[17]、先天性髖骨發(fā)育不良[18]、退變性腰椎間盤疾病[19]的發(fā)生有關(guān)，但目前少有GDF5與退變性腰椎滑脫癥椎間盤真空征的相關(guān)性研究。rs143383位點單核普酸多態(tài)性是目前GDF5基因多態(tài)性研究中最多、與骨關(guān)節(jié)病關(guān)系最為密切的位點之一，本研究rs143383位點等位基因頻率和基因型分布在真空征組和非真空征組均有顯著差異，提示GDF5作為骨骼系統(tǒng)及軟組織中重要的生長調(diào)控因子，其基因多態(tài)性可能與退變性腰椎滑脫癥患者椎間盤真空征的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，同時也驗證了rs143383位點可能是與椎間盤真空征存在關(guān)聯(lián)的微效應(yīng)位點。GDF5屬TGF-β超家族，GDF5可特異性與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合形成異源二聚體復合物[20-21]，將信號轉(zhuǎn)導至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因轉(zhuǎn)錄[22-23]。相關(guān)研究顯示GDF5通過P38MAP激酶信號轉(zhuǎn)導途徑促進骨祖細胞向軟骨細胞分化[24]，還可通過激活促分裂原活化蛋白激酶p38、ERK1/2活性促使黃韌帶細胞向成骨細胞分化，并上調(diào)堿性磷酸酶活性以及骨鈣素蛋白表達，形成礦化結(jié)節(jié)[25]。rs143383位點T等位基因過表達可下調(diào)GDFS基因轉(zhuǎn)錄活性，減少間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化，使關(guān)節(jié)軟骨細胞生成數(shù)量減少，導致蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少，下調(diào)腰椎負載能力，增加退變性腰椎疾病的易感性。

本組男女比例為1:5；女性患者比例明顯偏高，提示女性是腰椎滑脫癥椎間盤真空征的高發(fā)人群，其GDF5基因多態(tài)性可能與男性存在明顯差異化，為此，本研究進一步分析不同性別之間GDF5 rs143383基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女性基因頻率分布、等位基因頻率與男性存在顯著差異，其中顯性模型和隱性模型均有明顯統(tǒng)計學差異，提示攜帶T等位基因的退變性腰椎滑脫癥女性患者是椎間盤真空征的易感人群。Williams 等[26]對北歐退變性腰椎間盤疾病患者進行GDF5基因re143383位點基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)攜帶+104T/C女性是退變性腰椎間盤疾病的易感人群。分析其原因，與雌激素的促骨形成作用有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可促進轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor - β,TGF-β)家族成員-骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (Bone morphogenetic protein 2,BMP2 ) 基因轉(zhuǎn)錄，促進骨形成[27]。GDF5作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、TGF-β家族成員之一，其結(jié)構(gòu)和功能與BMP2類似，因此GDF5基因表達可能與雌激素水平存在相關(guān)性，導致了性別在GDF5 基因多態(tài)性在椎間盤真空征相關(guān)性方面的差異化出現(xiàn)。本研究Logisitic回歸分析結(jié)果顯示，GDF5基因多態(tài)性與椎間盤真空征的發(fā)生獨立相關(guān)，通過進一步校正混雜因素，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型個體發(fā)生椎間盤真空征的風險較高，提示T等位基因可能增加退變性腰椎滑脫患者椎間盤真空征的發(fā)生風險。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示攜帶GDF5 rs143383位點TT基因型的退變性腰椎滑脫癥患者發(fā)生椎間盤真空征易感性明顯增加，且該現(xiàn)象在女性患者中更為突出。本研究創(chuàng)新之處在于闡述了GDF5基因多態(tài)性與椎間盤真空征發(fā)生的關(guān)聯(lián)，這在以往研究少見；局限之處在于，椎間盤真空征見于多種退變性疾病，本研究僅以退變性腰椎滑脫患者為樣本，存在一定的局限性。上述局限均有待于在以后研究中擴大樣本數(shù)量，增加疾病種類，以探索不同脊椎疾病椎間盤真空征的遺傳學特征。