王建業(yè)，唐寧，呂丹

玻璃化冷凍是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣也是最為普遍的冷凍方式，它廣泛應(yīng)用于卵裂期胚胎、囊胚期胚胎、卵母細(xì)胞，甚至是精子的冷凍[1-5]，極大地提高了冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer, FET )周期患者的胚胎復(fù)蘇率和患者的累計(jì)妊娠率[6-7]，保障了FET周期患者成功率，減少了患者并發(fā)癥，也進(jìn)一步降低了不孕不育患者治療的總費(fèi)用。但早期不孕不育患者在接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療時多采用程序化的冷凍方式，對于這部分胚胎如果按照標(biāo)準(zhǔn)的慢速解凍(slow thawing, ST)方式進(jìn)行操作，解凍后胚胎有較高的卵裂球壞死率，胚胎利用率相對較低；按照玻璃化解凍(vitrificative thawing, VT)方式解凍玻璃化冷凍的胚胎，解凍后胚胎存活率高，胚胎利用率也相對較高[8-9]。但是否能用VT方式解凍程序化冷凍的胚胎，目前還在探討之中。本研究將比較VT和ST對程序化冷凍胚胎的影響，以期為程序化冷凍胚胎尋求更好的解凍方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2016年1月至2018年12月解放軍第九六〇醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET技術(shù)進(jìn)行助孕治療的胚胎解凍移植患者。使用隨機(jī)數(shù)生成軟件產(chǎn)生隨機(jī)分組數(shù)值，患者按照就診先后順序所對應(yīng)的隨機(jī)數(shù)分為VT組(200例，解凍液使用日本加藤的玻璃化解凍液)和ST組(200例，解凍液使用Quinn’s的慢速解凍液)。兩組患者夫婦的胚胎在冷凍時均為程序化冷凍方式。納入研究的患者年齡<37歲，不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩兀倥怕逊桨笧槎谭桨?。所有患者均按照醫(yī)院生殖倫理委員會要求，每一步操作都簽訂相應(yīng)的知情同意書。

1.2 方法

使用本中心常規(guī)方法，但略有改進(jìn)[10]，具體如下。

1.2.1 超促排卵 采用本生殖中心常規(guī)超促排卵方案，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 U。

1.2.2 取卵、受精和胚胎觀察 hCG注射后36 h在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵，取卵后3～5 h行體外受精(in vitro fertilization，IVF)，19～20 h觀察受精情況，6～7 h行卵胞漿內(nèi)單精子注射( intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，17～18 h觀察受精情況。授精后68～70 h觀察胚胎卵裂球和碎片數(shù)量，并以此判定卵裂期胚胎的級別。① Ⅰ級胚胎：卵裂球大小均勻，胞漿碎片<10% ；② Ⅱ級胚胎：卵裂球大小略不均勻，胞漿碎片<15% ；③ Ⅲ級胚胎：胞漿碎片<50%，卵裂球情況類似于Ⅱ級胚胎；④ Ⅳ級胚胎：胞漿碎片>50%。胚胎達(dá)6細(xì)胞以下，胚胎評級降低一個級別。解凍后胚胎有卵裂球死亡，胚胎評級降低一個級別。Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可用胚胎。兩組胚胎均在Labotect C 200培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有洗精和受精用培養(yǎng)液均使用Vitro Life產(chǎn)品。

1.2.3 所有解凍移植胚胎均使用程序化冷凍方法。

1.2.4 移植日測定患者子宮內(nèi)膜厚度，低于10 mm不予移植，不計(jì)入本研究統(tǒng)計(jì)范圍。

1.3 觀察指標(biāo)

① 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時的基本情況，包括年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、促性腺激素(gonadotropins，Gn)用量和基礎(chǔ)促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)值；② 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時胚胎發(fā)育情況，包括MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率；③ 比較兩組患者胚胎復(fù)蘇情況，包括胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率；④ 比較兩組患者胚胎移植情況和臨床妊娠結(jié)局，包括胚胎移植日移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度和臨床妊娠結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

所有患者均曾在中心接受IVF助孕。最近一次IVF周期檢查顯示：兩組患者年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表1。

2.2 胚胎發(fā)育情況

最近一次IVF周期胚胎發(fā)育情況顯示：兩組患者M(jìn)Ⅱ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 胚胎復(fù)蘇情況

VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組，兩組差異均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表3。

2.4 胚胎移植及妊娠結(jié)局

胚胎移植日，兩組患者移植次數(shù)、移植胚胎個數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度、移植后兩組患者臨床妊娠率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見78頁表4。

3 討論

自1978年第1例試管嬰兒誕生以來，越來越多不孕不育患者受益于輔助生殖技術(shù)。在眾多的輔助生殖技術(shù)中，冷凍和解凍技術(shù)是最重要的技術(shù)之一，最常用的冷凍和解凍方法包括程序化冷凍與ST及玻璃化冷凍與VT。程序化冷凍是最早使用的冷凍方法，采用“植冰”方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使用麥管作為冷凍載體，程序化降溫方式；玻璃化冷凍是后來使用的冷凍方法，采用高濃度冷凍保護(hù)劑，在極速降溫中形成玻璃態(tài)方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使用冷凍環(huán)、冷凍鉤或者冷凍片作為冷凍載體，急速降溫方式。ST使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體，避免解凍時的冰晶損傷；VT同樣使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體，避免解凍時的冰晶損傷?，F(xiàn)在多數(shù)學(xué)者和臨床胚胎學(xué)家認(rèn)為，玻璃化冷凍更適合胚胎的冷凍保存，玻璃化冷凍和解凍應(yīng)該全面代替程序化冷凍和ST[11-12]。只是兩種解凍方式使用的冷凍保護(hù)劑有所不同。這為我們使用VT方式代替ST方式，解凍程序化冷凍的胚胎，提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本研究中，所有進(jìn)入冷凍周期的患者都是最近接受IVF周期并有冷凍胚胎，隨機(jī)數(shù)分配形成VT組和ST組。兩組患者在年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值方面沒有差異，有共同的比較基礎(chǔ)。進(jìn)一步的胚胎發(fā)育比較顯示MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在影響冷凍和解凍的因素中，胚胎質(zhì)量和數(shù)量非常重要，胚胎發(fā)育的一致性使得兩組在比較解凍方法對冷凍效果的影響上有了較好的共同基礎(chǔ)，增加了比較的可行度。解凍結(jié)果顯示VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組，這表明了VT能達(dá)到比ST較好的解凍結(jié)果，這也意味著解凍同樣數(shù)量的冷凍胚胎，經(jīng)過VT可以獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎和可用胚胎用于胚胎移植。在實(shí)際的臨床實(shí)踐中，我們總是盡可能的保證在一次移植時有兩個優(yōu)質(zhì)胚胎，因此使用慢速冷凍意味著要解凍更多的胚胎。本研究中VT組解凍了523個胚胎，而ST組則解凍了603個胚胎。80個胚胎可能來自ST組解凍后的不可用胚胎，也可能來自復(fù)蘇后的多余可用胚胎。這表明ST不僅會造成更多的胚胎壞死，而且考慮到隨后的胚胎移植，還會造成更多的胚胎浪費(fèi)。由于兩組患者的移植次數(shù)、移植胚胎個數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度沒有差異，移植后的臨床妊娠率也沒有差異，但VT組移植胚胎數(shù)(2.13±0.26)還是略低于ST組(2.48±0.42)，而VT組臨床妊娠率(55.0%)卻略高于ST組(53.5%)，這表明VT比ST對臨床妊娠結(jié)果有一定提高，雖然這種提高并沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 患者基本情況

表2 胚胎發(fā)育情況(%)

表3 胚胎復(fù)蘇情況(%)

總之，對于程序化冷凍的胚胎，VT比ST提升解凍效果明顯，能夠更好地提高冷凍胚胎的利用率，進(jìn)而提高不孕不育患者的累計(jì)妊娠率，降低患者的妊娠花費(fèi)，是相對較好的胚胎解凍方法。但由于本研究樣本量有限，加之缺乏相關(guān)機(jī)理的深入探討，對玻璃化方法解凍程序化冷凍胚胎的研究還需要深一步探究。

表4 胚胎移植及妊娠結(jié)局