董君偉，賈海生

作為全球女性中第三大最常見的癌癥和惡性腫瘤相關死亡率的第四大突出原因，宮頸癌在全世界每年發(fā)生530 000例病例，近27.5萬例死亡，高于其他婦科腫瘤[1]。近年來，由于宮頸細胞學和宮頸活檢的進展，已經通過更好的檢測方法診斷出早期和局部晚期宮頸癌[2]。宮頸癌的篩查和先進的醫(yī)療手段使宮頸癌的發(fā)病率降低了40%～50%。在許多發(fā)達國家，死亡率降低了60%，預后良好率也有所提高[3]。然而，宮頸癌仍然是主要的公共衛(wèi)生問題，尤其是在晚期病例中[4]。過去的研究主要集中在識別可預測生物學行為的腫瘤特異性標志物上，主要是由于細胞運動的重要性和宮頸癌進展中的侵襲性[5]。為了進一步研究宮頸癌的治療，需要開展更多研究以研究宮頸癌的分子機制[6]。非編碼RNA(ncRNA)是基因調控的關鍵因素，影響正常細胞和癌細胞的表型[7]。 這些ncRNA被認為在腫瘤發(fā)生的起始中起著重要的調節(jié)作用[8]。最近，一類新的轉錄本，長鏈非編碼RNA(LncRNA)，已在真核基因組中廣泛轉錄[9]。LncRNA的長度約為200 nt至100 kb，是功能性非編碼RNA分子之一[10]。 據報道，宮頸癌中涉及幾種LncRNA[11]。到目前為止，僅對一小部分LncRNA進行了詳細表征[12]。一些LncRNA調控重要的癌癥過程，包括增殖、凋亡、轉移和耐藥性[13]。仍需要鑒定更多影響癌癥相關基因表達的LncRNA。

1 材料與方法

1.1 細胞及材料試劑

本研究中宮頸癌細胞Hela購于美國ATCC細胞庫。胎牛血清FBS、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher；Trizol試劑、脂質體2000購自美國Invitrogen；siRNA購自廣州市銳博生物科技有限公司；逆轉錄試劑及熒光定量PCR試劑購自翊圣(上海)有限公司；細胞增殖實驗反應MTS購于abcam公司; BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天；兔抗人MYC多克隆抗體、抗β-Actin抗體及HRP偶聯(lián)二抗購自英國Abcam?；蛐蛄衼碓从贜CBI數(shù)據庫，通過Primer 3.0軟件設計RT-PCR檢測引物，由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞Hela細胞購于美國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。細胞培養(yǎng)瓶置于含5%的CO2和95%濕度的37°C培養(yǎng)箱中。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.2 臨床數(shù)據篩選 在臨床數(shù)據庫GEPIA( Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[14]中，tumor/normal>2找到在宮頸癌中高表達的基因，并通過GEPIA數(shù)據庫找到與宮頸癌臨床預后密切相關的基因，進一步篩選LncRNA作為目的基因進行研究。

1.2.3 實時熒光定量PCR實驗(RT-qPCR) 反轉錄的cDNA用滅菌純水稀釋適當?shù)臐舛龋话阆♂?0倍，按照qPCR mix 5 μL，primer 1 μL, cDNA 4 μL的配方加入到96孔PCR板中；貼膜，以2 500 rpm離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進行實驗，反應完成后，拷貝數(shù)據，進行分析。

1.2.4 轉染 以6孔板轉染siRNA為例： 將1 μL siRNA與250 μL Opti-MEM混勻，1 μL lipo 2000與250 μL Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個孔中。

1.2.5 細胞增殖實驗 消化長滿的10 cm盤細胞，重懸于1 mL新鮮培養(yǎng)基中，用20 μL可鋪1個96孔板的密度鋪細胞，每個實驗組需3個實驗副孔，鋪好所需的實驗孔數(shù)。在5%的CO2，37℃條件下孵育。細胞貼壁后即可轉染siRNA，48 h后，開始測量吸光度。配制MTS反應液，按照MTS：培養(yǎng)液=1∶20的比例配制反應液。每孔加入100 μL MTS反應溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔半小時檢測一次吸光度。將培養(yǎng)皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結晶物。在490 nm處測量各孔的吸光值。將每天的吸光值轉換成代表每日細胞生長的參數(shù)，并繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 克隆形成實驗 以6孔板細胞為例：每孔鋪2 000個細胞，細胞貼壁后即可轉染siRNA。每個樣品做3個生物重復，待6～14 d之后出現(xiàn)肉眼可見的克隆，收集細胞，用常溫的PBS洗滌兩次，用甲醇、乙酸比為3∶1的固定液進行常溫固定5 min，用含0.5%結晶紫的甲醇溶液常溫固定15 min，水洗，直至背景紫色洗掉，室溫晾干進行掃描。

1.2.7 HallMark信號通路分析 將與CLIC 3共表達的基因在metascape數(shù)據庫[15]中進行分析,找到其參與的HallMark信號通路，為后續(xù)的研究提供理論基礎。

1.2.8 蛋白免疫印跡實驗 收細胞進行蛋白定量并制樣，準備電泳、電轉裝置，電泳液以及電轉液，裝樣品加入在凝膠中，100 V進行電泳，待藍色條帶跑出即進行電轉，100 V電轉2 h，將蛋白膜放在牛奶中封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜4次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，洗膜4次，每次5 min，暗房顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 宮頸癌目的LncRNA篩選及確定

通過GEPIA數(shù)據庫[14]，將在宮頸癌中高表達的有1 851個基因，和在宮頸癌中具有明顯臨床預后相關性的500個基因(P<0.05)進行重合性分析，共找到78個既在宮頸癌中高表達又具有顯著臨床意義的基因。通過將78個宮頸癌中高表達又具有顯著臨床意義的基因與人類基因組中14 871個LncRNA進行重合性分析，共找到3個可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有明顯作用的LncRNA：ATP 2A 1-AS1、SOX 21-AS1和DLEU1。研究發(fā)現(xiàn)3種LncRNA在宮頸癌組織中相比于宮頸正常組織顯著高表達，詳見圖1.1。其中ATP 2A 1-AS1和SOX 21-AS1在宮頸癌中呈現(xiàn)顯著的高表達預后好特征(P=0.0042、P=0.0023)，而DLEU1宮頸癌中呈現(xiàn)顯著的高表達預后差特征(P=0.0023)，詳見圖1.2(見彩插2)，根據致癌因子屬性(高表達預后差)，因此我們選擇DLEU1作為研究目的LncRNA。

2.2 DLEU1在Hela細胞中的敲低效率

RT-qPCR檢測轉染無義序列、兩條siDLEU1后的Hela細胞中DLEU1的表達水平。結果顯示：敲低DLEU1組的DLEU1的相對表達量與對照組相比有顯著降低(P=0.001、0.001)，詳見下頁圖2。該結果同時證明si DLEU1的有效性和脂質體轉染系統(tǒng)的可靠性。

2.3 敲低DLEU1對Hela細胞的生長速率影響

在轉染無義序列和siDLEU1后的Hela細胞中通過細胞增殖實驗和克隆形成實驗進一步評估DLEU1對Hela細胞生長速率的影響。細胞增殖實驗結果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達的細胞增殖速率顯著減慢，提示DLEU1促進宮頸癌細胞生長的作用(P<0.05，P<0.01)詳見下頁圖3.1?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達的細胞克隆形成速率顯著減慢，進一步驗證了DLEU1促進宮頸癌細胞生長的作用，詳見下頁圖3.2。

2.4 DLEU1主要定位于細胞核中發(fā)生作用

通過核質分離實驗，用經典位于細胞核中的標志LncRNA NEAT1和經典位于細胞質中的標志LncRNA DANCR作為對照，RT-qPCR實驗結果顯示DLEU1主要定位于細胞核中，詳見下頁圖4，為后續(xù)進一步探討DLEU1在宮頸癌中發(fā)揮作用的方式提供參考。

2.5 DLEU1可能參與調控MYC從而促進宮頸癌細胞的生長

通過將與DLEU1共表達基因在metascape數(shù)據庫[15]中參與的信號通路進行分析，探索DLEU1促進宮頸癌細胞生長的潛在分子機制。發(fā)現(xiàn)DLEU1顯著參與經典致癌基因MYC的調控，詳見下頁圖5。

圖1.1 GEPIA數(shù)據庫顯示3個LncRNA在宮頸癌中的表達情況

2.6 DLEU1正調控MYC的表達

轉染無義序列和siDLEU1后的Hela細胞中通過RT-qPCR實驗和蛋白免疫印跡實驗進一步評估DLEU1對MYC基因的表達調控。RT-qPCR結果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達的Hela細胞中MYC基因的RNA水平表達顯著降低(P=0.001、0.002)，詳見圖6.1。蛋白免疫印跡結果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達的Hela細胞中MYC基因的蛋白水平表達顯著降低，詳見圖6.2。由此提示了在宮頸癌細胞中DLEU1正調控經典致癌基因MYC的表達。

圖2 DLEU1在Hela細胞中的敲低效率

圖3.1 敲低DLEU1對Hela細胞增殖速率影響

圖3.2 敲低DLEU1對Hela細胞克隆形成速率影響

圖4 DLEU1主要定位于細胞核中

圖5 DLEU1可能參與調控MYC信號通路

圖6.1 RT-qPCR實驗驗證DLEU1正調控MYC的表達

圖6.2 蛋白免疫印跡實驗驗證DLEU1正調控MYC的表達

3 討論

宮頸癌是全球女性因婦科惡性腫瘤死亡的第四大死因，它需要新的潛在生物標記物進行診斷、治療和預后，以改善治療癌癥的臨床策略。近年來，LncRNA受到越來越多的關注。許多報告指出，LncRNA在生物學上對癌癥的發(fā)病機制很重要。有證據表明，LncRNA紊亂會導致一系列生物學功能，從而導致進行性腫瘤和不受限制的腫瘤生長。LncRNA已被用作生物標志物和預后指標[16]。人類基因組和轉錄組測序的進步表明，大多數(shù)人類基因組都可以轉錄，但是只有一小部分的轉錄本可以編碼蛋白質[17]。LncRNA通常調控不佳，現(xiàn)在已知在基因表達和各種生物學過程中起著越來越重要的作用，并且可以為宮頸癌提供一種新穎的治療方法[18]。研究表明，LncRNA已在包括宮頸癌在內的多種腫瘤中異常表達[19]，例如LncRNA NORAD[20]，TPT1-AS1[21]和NEAT 1[22]可以促進宮頸癌細胞的生長和轉移。HOXD-AS1激發(fā)宮頸癌中的阿霉素抗性[23]。HOTAIR和CCHE 1在宮頸癌組織中過表達，HOTAIR和CCHE 1的高表達是宮頸癌的陰性預后因素[24]。在本文中，我們通過GEPIA數(shù)據庫將宮頸癌中高表達的基因和具有顯著臨床預后相關性的基因進行重合性分析，共篩選到78個在宮頸癌中既高表達又具有顯著宮頸癌臨床預后相關性的基因，進一步將這78個基因進行分類，篩選到3個LncRNA：ATP 2A 1-AS1、SOX 21-AS1和DLEU1，最后根據高表達預后差原則確定DLEU1作為研究目的LncRNA。

據報道，位于13q14.3染色體上的LncRNA DLEU1在慢性淋巴細胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤，乳腺癌，胃癌和卵巢癌中失調[25]。DLEU1的高表達與胃癌的預后不良有關，并有助于細胞增殖。 顯示DLEU1通過與miR-490-3p相互作用來促進卵巢癌細胞增殖和侵襲[26]。迄今為止，研究表明DLEU1在幾種腫瘤中起著致癌LncRNA的作用[27]。但是，關于DLEU1在宮頸癌中的作用和上游調節(jié)機制知之甚少。在本文中，利用細胞增殖實驗及克隆形成實驗，我們同樣發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中敲低DLEU1的表達，會顯著減慢宮頸癌細胞增殖和克隆形成速率，說明DLEU1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的致癌因子屬性。為了進一步探討DLEU1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮功能的潛在分子機制，作為LncRNA，我們首先研究了DLEU1的核質定位，發(fā)現(xiàn)DLEU1主要分布在細胞核中，而在細胞核中，一般都是通過調控發(fā)揮功能，因此我們便將與DLEU1共表達的基因在metascape中進行分析，發(fā)現(xiàn)DLEU1可能參與調控經典的致癌因子MYC。MYC是一種多功能轉錄因子，可調節(jié)包括發(fā)育和分化在內的各種過程。它的調控功能之一涉及基因轉錄，在該基因轉錄中，它與位于基因啟動子區(qū)域的E-box序列(CANNTG)結合。據估計，MYC靶基因網絡構成了從蒼蠅到人類的所有基因的約15%。MYC基因敲除對小鼠具有致死性，可導致較小的胚胎和發(fā)育遲緩[28]。MYC還是細胞周期的重要調節(jié)劑，其敲除或敲低會嚴重影響細胞增殖[29]。 它還在細胞分化中起作用。MYC是由長期造血干細胞分化誘導的，并平衡干細胞的自我更新和分化。在小鼠胚胎干細胞中，MYC通過誘導miRNA表達來抑制分化標記基因的表達并影響干細胞的分化[30]。由此可見MYC在細胞進程中的重要性，為了證明DLEU1對MYC的調控作用，我們在敲低DLEU1表達的宮頸癌細胞中進行驗證，發(fā)現(xiàn)敲低DLEU1的表達，不管是從RNA水平還是蛋白水平,MYC的表達都被降低，說明在宮頸癌細胞中DLEU1確實正調控經典致癌因子MYC的表達。

綜上所述，宮頸癌中DLEU1可能通過高表達導致經典致癌因子MYC的高表達，因此促進宮頸癌細胞的增殖。