羅 強(qiáng)，李幸洋，陳煉紅，張 明，劉 巧，張大偉，羅 璠,*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用國家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

發(fā)酵蔬菜是以乳酸菌主導(dǎo)厭氧發(fā)酵而生產(chǎn)加工的傳統(tǒng)食品[1]，在我國有悠久的歷史。常見的發(fā)酵蔬菜制品包括咸菜、泡菜、醬菜等。蔬菜經(jīng)過發(fā)酵處理后，不僅能延長新鮮蔬菜的貯藏期[2]，還能改善風(fēng)味，增進(jìn)食欲，提升蔬菜的營養(yǎng)價(jià)值[3]，同時(shí)也具有降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化等[4-6]保健作用。在我國北方地區(qū)，以新鮮白菜為主要材料，用鹽水長時(shí)間腌漬而成的發(fā)酵泡菜，是當(dāng)?shù)鼐用裰饕氖止ぷ灾瓢l(fā)酵食品之一。

自制發(fā)酵蔬菜多數(shù)采用天然接種，由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多菌種混合發(fā)酵而成，其中乳酸菌起到重要作用。前期研究表明，成品北方泡菜中含有豐富的乳酸菌資源，涉及十多個(gè)屬一百多個(gè)種，其中以乳桿菌屬最為豐富[7]。蔬菜在發(fā)酵過程中也表現(xiàn)出明顯的菌群更替現(xiàn)象，多數(shù)研究表明發(fā)酵前期以腸膜明串珠菌為優(yōu)勢菌群，后期以短乳桿菌和植物乳桿菌為優(yōu)勢菌[8-9]，乳桿菌屬作為終止發(fā)酵的主要菌群使得發(fā)酵蔬菜快速成熟，其中蘊(yùn)含大量的產(chǎn)酸耐酸優(yōu)質(zhì)菌種。金成武等[10]從市售泡菜中篩選到1 株植物乳桿菌Q2，其24 h發(fā)酵液pH值達(dá)到3.79；王惋等[11]從黑龍江農(nóng)戶家中所發(fā)酵的自然泡菜中，以pH 3.0為篩選條件篩選了一批酸耐受性良好的乳酸菌株。這些產(chǎn)酸和耐酸性能優(yōu)良的菌株在各個(gè)領(lǐng)域均能得到廣泛應(yīng)用：在食品行業(yè)中，菌株較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)酸能力能夠顯著縮短工業(yè)化發(fā)酵進(jìn)程，提升生產(chǎn)效率，含有強(qiáng)耐酸性乳酸菌的發(fā)酵食品經(jīng)食用后能夠耐受酸性的腸胃環(huán)境，更利于發(fā)揮乳酸菌的益生性質(zhì)；在飼料行業(yè)中，產(chǎn)酸和耐酸性能優(yōu)異的乳酸菌株能夠制作益生菌飼料，經(jīng)動物食用并定值后，產(chǎn)生的代謝物能更好抑制腸道內(nèi)病原菌，調(diào)節(jié)腸道菌群，提升動物免疫力[12]，對于動物生長性能也有較大提升[13]。因此，篩選具有優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酸耐酸性能的乳酸菌株具有較明顯的應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過對來自遼寧、河南、吉林及內(nèi)蒙古自治區(qū)等不同地區(qū)采集的20 份泡菜樣品進(jìn)行乳酸菌的分離與鑒定，研究不同地區(qū)泡菜中微生物菌群的多樣性，通過產(chǎn)酸、耐酸實(shí)驗(yàn)，篩選一批產(chǎn)酸和耐酸能力優(yōu)異的菌株，以期為食品及飼料添加劑中優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源的開發(fā)提供后備菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品分別來自遼寧、河南、吉林和內(nèi)蒙古自治區(qū)4 個(gè)地區(qū)使用當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)工藝制作而成的自然發(fā)酵農(nóng)家泡菜，每個(gè)地區(qū)采集5 份樣品，共計(jì)20 份樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基和BCP產(chǎn)酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，向MRS肉湯培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂制成培養(yǎng)平板用于菌株分離純化。

2×Taq Master Mix 即用型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液 康潤生物科技有限公司；1×TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0）；引物Eu27F、1495R、rpoA-21-F和rpoA-23-R由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；SuperRed/GelRed核酸染料 北京白鯊易科技有限公司；胃蛋白酶（酶活力10 000 U/g）美國Sigma公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ST16R高速冷凍離心機(jī)、NanoDrop2000微量核酸測定儀 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000電熱恒溫培養(yǎng)箱天津泰斯特設(shè)備有限公司；ETC811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng)中國天能公司；Vortex-BE1旋渦混合器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；UV1900紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；R40-IIB2超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；雷磁PHSJ-3F精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；AE-30生物顯微鏡 麥克奧迪有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜樣品采集

選取發(fā)酵后期且風(fēng)味良好的農(nóng)家天然發(fā)酵泡菜，將罐中蔬菜與汁液充分搖晃混勻后，用無菌移液器吸取適量泡菜汁液轉(zhuǎn)移至滅菌采樣瓶中，置于冰上低溫存放并轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 泡菜樣品中產(chǎn)酸菌的計(jì)數(shù)和分離

充分振蕩采樣瓶，吸取10 mL泡菜汁加入含有90 mL 0.85%（V/V）無菌生理鹽水的三角瓶中充分混勻，采用10 倍梯度稀釋法對樣品進(jìn)行稀釋，吸取10-4～10-7稀釋度的稀釋液100 μL涂布于BCP固體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。選取菌落數(shù)適宜的稀釋度平板，對產(chǎn)生黃色圈的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 乳酸菌的純化

挑取產(chǎn)生黃色圈的菌落于MRS固體平板上進(jìn)行多次平板劃線培養(yǎng)直至得到單菌落，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色。凡革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株作為疑似乳酸菌，增菌培養(yǎng)后于-20 ℃凍存于含有體積分?jǐn)?shù)25%甘油的MRS培養(yǎng)基中[14]。

1.3.4 16S rDNA基因同源性分析

疑似乳酸菌株經(jīng)活化后使用微波提取法[15]抽提總DNA 并擴(kuò)增其16SrDNA 基因序列。16SrDNA 擴(kuò)增引物：正向引物EU 27 F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1495R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’[16]。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：上下游引物各2 μL（10 pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，無菌雙蒸水7.5 μL，2×TaqPCR MasterMix預(yù)混酶12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫備用[17]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列測定。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對鑒定。當(dāng)序列相似度達(dá)到97%時(shí)，判定為同一個(gè)屬，而序列相似度達(dá)到99%時(shí)，則判定為同一個(gè)種[18]。其中對于基因序列高度相似的腸球菌屬只鑒定至屬水平，后續(xù)待篩選得到優(yōu)良菌株后對其種屬做進(jìn)一步鑒定。

1.3.5 產(chǎn)酸能力初步篩選

將已鑒定種屬的乳酸菌株37 ℃活化培養(yǎng)18 h后，以2%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基（pH 6.50）中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液pH值。

1.3.6 產(chǎn)酸特性分析[19]

選取1.3.5節(jié)篩選得到的發(fā)酵液pH值低于4.0的乳酸菌株，37 ℃活化18 h，6 000 r/min離心10 min得到菌體，使用0.9%無菌生理鹽水重懸并調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×108CFU/mL，以2%接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基（pH 6.50）中于37 ℃培養(yǎng)，在第2、4、6、8、10、12、18、24小時(shí)測定發(fā)酵液pH值并繪制變化曲線。

1.3.7 乳酸菌株的耐酸能力測定

參照中國藥典配制人工胃液[20]，菌株耐酸能力測定參照文獻(xiàn)[21]并加以修改，挑取產(chǎn)酸性能較好的乳酸菌株活化18 h，吸取菌液10 mL于離心管中，6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌2 次，在菌體中加入10 mL人工胃液，旋渦混勻后于37 ℃、200 r/min搖床溫浴，在0 h和3 h測定人工胃液處理前后的活菌數(shù)量，根據(jù)下式計(jì)算菌株存活率：

式中：N1為經(jīng)過人工胃液處理后乳酸菌數(shù)量；N0為人工胃液處理前的乳酸菌數(shù)量。

1.3.8 腸球菌屬菌株rpoA管家基因的序列同源性分析

通過16S rDNA序列測定不能準(zhǔn)確區(qū)分腸球菌的種類，因此使用管家基因rpoA（RNA polymeraseα-chain）對耐酸性能優(yōu)異的腸球菌屬乳酸菌進(jìn)一步分類鑒定，引物序列、退火溫度及擴(kuò)增位點(diǎn)見表1。

表1 管家基因rpoA的引物序列和退火溫度Table 1 Primer sequences and annealing temperatures for rpoA used in this study

PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA 1 μL，2×TaqMaster Mix預(yù)混酶12.5 μL，正反引物各1 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，3 次循環(huán)（95 ℃變性60 s，46 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），30 次循環(huán)（95 ℃變性35 s，48 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存?zhèn)溆肹23]。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小。序列測定、同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參照步驟1.3.4節(jié)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)泡菜汁中產(chǎn)酸菌的分離與計(jì)數(shù)

通過BCP平板對4 個(gè)不同地區(qū)來源的樣品中產(chǎn)酸菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2所示。不同來源的樣品中產(chǎn)酸菌數(shù)量具有一定差別，其中來源于吉林省的5 份樣品平均產(chǎn)酸活菌數(shù)明顯高于其他地區(qū)，前期測定結(jié)果也顯示吉林樣品的pH值最低。

表2 不同地區(qū)來源的發(fā)酵泡菜中產(chǎn)酸菌數(shù)量Table 2 Number of lactic acid bacteria in traditional pickles from different regions

2.2 16S rDNA序列鑒定與菌群組成

采用微波法提取菌株基因組DNA后經(jīng)微量核酸檢測儀檢測，得到DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.1之間，符合擴(kuò)增模板要求。將DNA質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至100 mg/L作為擴(kuò)增模板，對16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。如圖1所示，各泳道在1 500 bp左右位置出現(xiàn)明顯可見的亮帶，無明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，符合測序要求。

圖1 部分乳酸菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA of selected strains of lactic acid bacteria

經(jīng)過16S rDNA序列分析和BLAST同源性比對，20 份樣品中共分離出4 個(gè)乳酸菌屬共計(jì)435 株菌。在所有分離株中，乳桿菌屬（Lactobacillus）6 個(gè)種共394 株（占總菌數(shù)的90.57%），占據(jù)了分離株的絕對比例，腸球菌屬（Enterococcus）共計(jì)38 株（占總菌數(shù)的8.74%），另外還從遼寧和河南地區(qū)樣品中各分離得到2 株腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和1 株暹羅片球菌（Pediococcus siamensis）。

圖2 不同地區(qū)泡菜源分離出的乳酸菌多樣性Fig. 2 Diversity of lactic acid bacteria isolated from pickles from different areas

根據(jù)各地區(qū)泡菜發(fā)酵后期的乳酸菌菌群組成情況建立了乳酸菌多樣性柱狀堆積圖。如圖2所示，遼寧和河南地區(qū)的泡菜樣品中菌群組成最為豐富，共分離出6 種乳酸菌，吉林次之（4 種），而內(nèi)蒙古地區(qū)只分離出3 種乳酸菌，其乳酸菌群豐富度明顯少于其他地區(qū)。4 個(gè)地區(qū)樣品中均分離得到短乳桿菌（L. brevis）、植物乳桿菌（L. plantarum）和腸球菌屬。其中短乳桿菌在4 個(gè)地區(qū)的樣品中均占據(jù)最大比例，在各地區(qū)所占比例在58.59%～82.61%之間，是發(fā)酵后期泡菜中的優(yōu)勢菌群，與前期研究一致[24-25]。另外腸球菌屬在4 個(gè)地區(qū)的樣品中均有檢出，與相關(guān)報(bào)道相似[26-27]，但不同的是本研究篩選到的腸球菌屬除在吉林來源的樣品中含量較高，占據(jù)其總分離株的22.22%外，在其他3 個(gè)地區(qū)的樣品中含量均較低，不屬于優(yōu)勢菌群，且它們均是在成熟泡菜中篩選得到，說明耐酸能力較強(qiáng)。有研究表明[28]，泡菜中的腸球菌屬具有較為出色的亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力，能夠控制發(fā)酵泡菜中的亞硝酸鹽含量，對提高發(fā)酵泡菜的益生性都有明顯的作用。

本研究顯示4 個(gè)不同地區(qū)的泡菜中優(yōu)勢菌群比較一致，但菌群組成上有較為明顯的差別，該結(jié)果與李欣[29]、孫慧君[30]等的研究結(jié)果相似。這可能與泡菜加工時(shí)的外界因素，如溫度、鹽度、工藝、品種等有關(guān)[31]。

2.3 高產(chǎn)酸菌株篩選結(jié)果

產(chǎn)酸能力是乳酸菌活力良好的重要特征之一，測定435 株已鑒定乳酸菌株發(fā)酵24 h的發(fā)酵液pH值，結(jié)果如圖3所示。435 株乳酸菌中，24 h發(fā)酵液pH值集中在3.50～5.00之間，其中pH值在4.00～4.50之間的菌株最多，pH值在3.50～4.00之間有87 株，另外只有11 株菌的24 h發(fā)酵液pH值低于3.5。在24 h發(fā)酵液pH值低于4.0的98 株菌中，乳桿菌屬約占94.9%。

圖3 全部乳酸菌株24 h發(fā)酵液pH值分布情況Fig. 3 Grouping of 435 strains of lactic acid bacteria by pH after 24 h culture

2.4 產(chǎn)酸曲線

根據(jù)產(chǎn)酸初篩結(jié)果，選取所有發(fā)酵液pH值低于4.0的乳酸菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)酸曲線。結(jié)果顯示，多數(shù)菌株在培養(yǎng)前期pH值均快速下降，在12 h左右pH值變化減緩，24 h的終pH值在3.3～4.0之間。通過測定所有98 株菌產(chǎn)酸曲線發(fā)現(xiàn)，腸膜明串珠菌LR-90和短乳酸桿菌NR-20的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。最終挑選出29 株產(chǎn)酸快、終pH值低于3.6的菌株用于后續(xù)耐酸實(shí)驗(yàn)。其中有17 株來源于吉林地區(qū)，圖4為部分菌株的產(chǎn)酸曲線。

圖4 菌株24 h的產(chǎn)酸曲線Fig. 4 Acid production curves of six selected strains over 24 h

2.5 耐酸菌株的篩選結(jié)果

將29 株高產(chǎn)酸乳酸菌在pH 2.0模擬人工胃液環(huán)境下孵育3 h進(jìn)行耐酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，菌株的存活率范圍為0%～93%，呈現(xiàn)了較大的差異。存活率在70%以上的乳酸菌共9 株，如表3所示，占高產(chǎn)酸總菌數(shù)的22.5%，其中植物乳桿菌NR-11和LR-13、棒狀乳桿菌LR-43的存活率在90%以上，表現(xiàn)出對模擬胃酸較強(qiáng)的耐受性。

表3 pH 2.0模擬胃液環(huán)境下菌株的存活率Table 3 Effect of simulated gastric fluid at pH 2.0 on survival rate of 29 acid-producing strains of lactic acid bacteria

結(jié)合產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的LR-90，耐酸能力不表現(xiàn)明顯增強(qiáng)，在人工胃液處理3 h后，存活率不到70%，而耐酸能力較強(qiáng)的NR-11、LR-13、LR-43產(chǎn)酸能力并不具有明顯優(yōu)勢，這與林龍鎮(zhèn)等[32]的研究一致。因此，菌株產(chǎn)酸能力與耐酸能力之間有否相關(guān)性還有待深入探討。

2.6 rpoA基因同源性分析

由于在耐酸性實(shí)驗(yàn)中，2 株腸球菌屬菌株JR-14和NR-59的存活率較高，也體現(xiàn)出較強(qiáng)的研究價(jià)值，因此通過rpoA管家基因測序?qū)⑵滂b定至種水平。根據(jù)rpoA基因序列測序結(jié)果，菌株NR-59和JR-14菌株E. faeciumSRCM103470的rpoA基因序列同源性分別為100%和99.83%，圖5展示了通過rpoA管家基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合16S rDNA序列和2 株腸球菌屬乳酸菌在rpoA管家基因系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置，確定了2 株菌為屎腸球菌（E. faecium）。

圖5 2 株腸球菌屬乳酸菌rpoA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on rpoA sequences of two strains of Enterococcus

3 結(jié) 論

采用BCP產(chǎn)酸培養(yǎng)基對北方4 個(gè)不同地區(qū)來源的20 份泡菜樣品進(jìn)行菌種篩選和計(jì)數(shù)，初步分離得到435 株疑似乳酸菌，經(jīng)過16S rDNA序列同源性分析，共得到乳桿菌屬6 個(gè)種共394 株，腸球菌屬共38 株，2 株腸膜明串珠菌和1 株暹羅片球菌。

4 個(gè)地區(qū)泡菜樣品中乳酸菌群在種水平上表現(xiàn)出地區(qū)差異性，來源于遼寧和河南地區(qū)的泡菜樣品乳酸菌多樣性較高，來源于吉林的樣品中產(chǎn)酸菌最多，以乳桿菌屬為代表的乳酸菌群主導(dǎo)了各地區(qū)發(fā)酵蔬菜的成熟，其中以短乳桿菌所占比例最高，是各地區(qū)泡菜中的最優(yōu)勢菌種。

進(jìn)一步對435 株乳酸菌產(chǎn)酸初篩和產(chǎn)酸曲線測定，以及在pH 2.0人工胃液下進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)，最終篩選得到9 株產(chǎn)酸和耐酸性質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌株，其中包括7 株乳桿菌和2 株腸球菌，通過rpoA管家基因序列對腸球菌進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)2 株腸球菌均為屎腸球菌。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的9 株乳酸菌產(chǎn)酸耐酸能力強(qiáng)，是進(jìn)一步深入研究與應(yīng)用的備選菌株。