李賀　李艷　趙今

[摘要]目的：對(duì)比不同質(zhì)量濃度下芍藥總多糖對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及合成水不溶性多糖（water insoluble glucan，WIG）含量的影響。方法：自行提取芍藥總多糖，連續(xù)稀釋法測(cè)定芍藥總多糖對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長(zhǎng)的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）與最低殺菌濃度（minimal bactericidalconcentration，MBC）；將芍藥總多糖倍比稀釋為小于MIC的4個(gè)質(zhì)量濃度組，以腦心浸液液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，加入108CFU/ml的變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌菌懸液，厭氧培養(yǎng)24h及.48h。pH計(jì)測(cè)定pH值，計(jì)算ΔpH值（初始pH～終末pH）。蒽酮法測(cè)定WIG含量。結(jié)果：①芍藥總多糖對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長(zhǎng)均有抑制作用，其最低抑菌濃度變異鏈球菌為110.4mg/ml，血鏈球菌為27.6 mg/ml，黏性放線菌為13.8 mg/ml；②培養(yǎng)48h后，ZXpH值均隨芍藥總多糖質(zhì)量濃度的增大而減小。變異鏈球菌實(shí)驗(yàn)組除1/4MIC、1/2MIC組之外，其余各組間的ApH值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。血鏈球菌1/2MIC組同對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。黏性放線菌各組間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；③培養(yǎng)24h，WIG含量隨芍藥總多糖質(zhì)量濃度的增大而減小。變異鏈球菌1/2MIC組及血鏈球菌1/4MIC及1/2MI組同對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：芍藥總多糖對(duì)浮游狀態(tài)下的變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌的生長(zhǎng)及變異鏈球菌、血鏈球菌產(chǎn)糖、產(chǎn)酸有不同程度抑制作用。

[關(guān)鍵詞]芍藥；總多糖；生長(zhǎng)；產(chǎn)酸；防齲

[中圖分類號(hào)]R781 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）04-0041-04

芍藥總多糖是從芍藥中提取出的主要活性物質(zhì)。武新華等報(bào)道芍藥提取物能夠不同程度抑制金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌等的生長(zhǎng)，而其對(duì)口腔細(xì)菌的影響尚不明確。變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌均為是口腔常駐菌。變異鏈球菌是菌斑生物被膜的常見菌，是與齲病發(fā)生關(guān)系密切的致病菌。血鏈球菌在牙菌斑生物被膜形成和細(xì)菌在牙體硬組織上聚集定植都有著重要作用。黏性放線菌對(duì)其他致齲菌進(jìn)一步的粘附定居有協(xié)同作用。這些細(xì)菌在齲病形成的過程中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)選擇了以上細(xì)菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究芍藥總多糖化學(xué)組分對(duì)浮游狀態(tài)下變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸、產(chǎn)水不溶性胞外多糖作用的影響，進(jìn)一步探索評(píng)估其防齲效能。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株、儀器及菌懸液、試劑制備。

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株：變異鏈球菌ATCC 76100、血鏈球菌ATCC10556及黏性放線菌ATCC 19246均由口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室口腔生物學(xué)研究室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP 9162），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Forma Direct heat c02 Incubator Thermo Fisher Scientific，P.O.Box 649Marietta，OH 45750，USA），電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ LM SII，上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備制造廠），低溫超速離心機(jī)（德國(guó)艾本德eppendorf，型號(hào)5417C），pH計(jì)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，Sartorius AG），分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司，Spectrumlab 22型），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Human，德國(guó)）。

1.1.3菌懸液制備及試劑配置

1.1.3.1菌懸液：將實(shí)驗(yàn)菌株接種于BHI-S瓊脂血平板，置厭氧箱中37℃下復(fù)蘇48h，涂片鏡檢，隨機(jī)選取菌株行生化鑒定，確定為單純培養(yǎng)后于BHI固體培養(yǎng)基接種傳代，置37℃下厭氧培養(yǎng)24h。檢查菌落生長(zhǎng)形態(tài)，鏡檢無污染，接種環(huán)挑選單菌落移至BHI液體培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)18h增菌；應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液濃度，BHI培養(yǎng)液稀釋上述培養(yǎng)物，并用比濁儀校正至1.0McFarland（相當(dāng)于3×10³CFU/ml）。

1.1.3.2蒽酮試劑：稱取200mg蒽酮溶解于100ml濃硫酸中，充分?jǐn)嚢枞芙?，置?℃保存。

1.1.3.3芍藥總多糖：新疆赤芍（新疆阿勒泰產(chǎn)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院鑒定）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1芍藥總多糖對(duì)口腔細(xì)菌最低抑菌濃度及最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定：將提取的芍藥總多糖干粉0.552g，過微孔濾膜后（0.22μm），用生理鹽水配成濃度為110.4mg/ml的原液。將原液稀釋溶于BHI液體培養(yǎng)基中。并倍比稀釋為六個(gè)濃度梯度，使其最終濃度達(dá)到3.45、6.9、13.8、27.6、55.2、110.4mg/ml。將細(xì)菌懸液與各組藥液倍比稀釋（V/V），接種后震蕩60s后，置于20%CO₂，36℃下厭氧培養(yǎng)48h。置于暗色、無反光物體表面，肉眼觀察無渾濁出現(xiàn)的最低藥物濃度為其MIC（最低抑菌濃度）值；若結(jié)果不易判斷，挑取少量菌液接種于BHI固體培養(yǎng)基上，置于20%CO₂，36℃下厭氧培養(yǎng)48h，觀察是否有菌落生長(zhǎng)。最低抑菌濃度測(cè)定重復(fù)3次。選擇大于最低抑菌濃度濃度的各孔，混勻培養(yǎng)基，分別取20μl涂于BHI固體培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)24h，觀察菌落少于5～6個(gè)的最低濃度為最低殺菌濃度（MBC）。實(shí)驗(yàn)分組，陽性對(duì)照組：含1%葡萄糖的BHI菌懸液液體培養(yǎng)基，每組4個(gè)平行；陰性對(duì)照組：含0.05%洗必泰，每組4個(gè)平行；實(shí)驗(yàn)組：含6種不同濃度芍藥總多糖，每組4個(gè)平行。

1.2.2芍藥總多糖對(duì)口腔三種致齲菌產(chǎn)酸作用影響的測(cè)定：用BHI液體培養(yǎng)基將芍藥總多糖配成最低抑菌濃度濃度值，另配含5%蔗糖的PBS緩沖液，用酸度計(jì)將兩者調(diào)定初始pH值為7.4，高壓滅菌器中0.1MPa、121.5℃高壓15min，根據(jù)芍藥總多糖對(duì)上述三種致齲菌的最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果，將待測(cè)藥液按倍比稀釋法配置成最低抑菌濃度值以下的4個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組，每組3平行管。菌懸液與藥液按1：10（V/V）分別接種3種細(xì)菌，10%C02，36℃厭氧箱中培養(yǎng)48h，利用PH計(jì)測(cè)定其pH值，并計(jì)算ApH值（初始pH～終末pH）?？瞻讓?duì)照組以空的培養(yǎng)基ApH值。實(shí)驗(yàn)包括4個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組與1個(gè)不含藥物的空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 WIG含量測(cè)定：蒽酮法測(cè)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算胞外wIG含量。

1.2.4數(shù)據(jù)分析：使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用單因素方差分析進(jìn)行分析。若差異用統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用單因素方差分析Dunnett t雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)一步比較各實(shí)驗(yàn)組間及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組問的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1 MIC測(cè)量結(jié)果

芍藥總多糖對(duì)變異鏈球菌、黏性放線菌、血鏈球菌均有抑制作用，其最低抑菌濃度分別是變異鏈球菌為110.4mg/ml，血鏈球菌為27.6mg/ml，黏性放線菌為13.8 mg/ml。

2.2芍藥總多糖對(duì)口腔三種致齲菌產(chǎn)酸作用影響的測(cè)定

不同質(zhì)量濃度芍藥總多糖△pH值見表1。變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌產(chǎn)酸隨著芍藥總多糖濃度的升高而減少。培育48h，變異鏈球菌對(duì)照組、1/16MIC、1/SMIC的△pH值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1/4MIC、1/2MIC的△pH值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示1/4MIC、1/2MIC質(zhì)量濃度的芍藥總多糖可較長(zhǎng)久抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸。同理1/2MIc質(zhì)量濃度芍藥總多糖可較長(zhǎng)時(shí)間抑制血鏈球菌。而芍藥總多糖對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸能力的影響與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3芍藥總多糖對(duì)致齲菌合成WIG的影響

不同質(zhì)量濃度芍藥總多糖合成WIG的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2?？梢姡?/2MIC及I/4MIC、1/2MIC質(zhì)量濃度的芍藥總多糖分別對(duì)變異鏈球菌，血鏈球菌產(chǎn)生水不溶性胞外多糖的抑制作用較強(qiáng)（P<0.05）。同時(shí)其在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)黏性放線菌產(chǎn)糖幾乎沒有作用。

3討論

現(xiàn)代口腔生態(tài)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為：變異鏈球菌、黏性放線菌、血鏈球菌為主要的口腔致齲細(xì)菌，齲病的發(fā)生是口腔微生態(tài)系統(tǒng)失衡的結(jié)果。研究表明變異鏈球菌在恒牙和乳牙齲病的發(fā)生和發(fā)展過程中都起著重要的作用，是齲病的主要致病菌，并被認(rèn)為是口腔生物膜中致齲性最強(qiáng)的微生物之一。血鏈球菌是菌斑生物被膜最初形成過程中較早粘附定植的菌群。黏性放線菌在菌斑生物膜中對(duì)變異鏈球菌粘附聚集牙面有協(xié)同作用，協(xié)同促進(jìn)根面菌斑形成及根面齲的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)選擇了3種標(biāo)準(zhǔn)菌株，即變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌，以研究藥物對(duì)浮游狀態(tài)口腔主要致齲菌的影響。其中血鏈球菌為口腔菌斑形成的先鋒菌，黏性放線菌則可介導(dǎo)多種口腔細(xì)菌在菌斑中的集聚，而變異鏈球菌則是主要致齲菌。這樣的菌株選擇能夠較大程度上反應(yīng)口腔細(xì)菌菌群構(gòu)成。

近年，天然藥物因藥理活性強(qiáng)、毒性低、來源豐富等優(yōu)點(diǎn)，其在齲病防治中的優(yōu)勢(shì)日益顯著。目前已發(fā)現(xiàn)許多天然藥物都具有防齲作用。新疆赤芍是新疆芍藥和塊根芍藥的總稱，產(chǎn)于新疆阿勒泰地區(qū)，為傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥。目前現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了芍藥粗提物可不同程度抑制金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)。但其對(duì)口腔主要致齲菌影響研究甚少。本實(shí)驗(yàn)提取新疆赤芍中的總多糖，就浮游狀態(tài)下的上述三種細(xì)菌，測(cè)定總多糖對(duì)其生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖作用的影響，評(píng)估其防齲效能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥總多糖對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌的生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)浮游狀態(tài)下的變異鏈球菌及血鏈球菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)水不溶性胞外多糖有著較強(qiáng)的抑制作用。因此，可推測(cè)芍藥總多糖能有效抑制致齲菌的生長(zhǎng)和代謝，抑制致齲菌的毒力因子，有一定的抑制致齲菌的效果。

編輯/張惠娟