張雪穎

摘?要：乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素由于其作為天然防腐劑和化學(xué)防腐劑的天然替代品而受到越來(lái)越多的關(guān)注。對(duì)從食物分離株RM1產(chǎn)生的細(xì)菌素（Ent-RM1）的特性及應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：篩選的細(xì)菌素 Ent-RM1具有較高的熱穩(wěn)定性和較寬的pH穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶K敏感。用16%的三-三甲基十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，Ent-RM1的分子量約為4.0k～4.5kDa。硫酸銨沉淀法提取的 Ent-RM1（44.7 IU/mL Nisin當(dāng)量）對(duì)接種到牛乳中的單核細(xì)胞增生李斯特菌 Scott A有殺菌作用，對(duì)蠟狀芽孢桿菌ATCC 11778具有抑菌作用。在磷酸鹽緩沖液與高壓處理聯(lián)合作用，Ent-RM1對(duì)大腸桿菌K12表現(xiàn)出協(xié)同滅活作用，表明Ent-RM1對(duì)控制食品工業(yè)中的細(xì)菌污染具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：食物分離株細(xì)菌素Ent-RM1;熱穩(wěn)定;耐酸;殺菌;滅菌

腸球菌是溫血?jiǎng)游镂改c道內(nèi)的正常菌群，由于其GRAS（Generally Recognized as Safe）特性而被廣泛用于食品工業(yè)[1-2]。在多種食物中均可分離到腸球菌，包括牛奶[3]、蔬菜[4]，奶酪[5-7]和香腸[8]等發(fā)酵食品。由于其蛋白水解、脂解酶活性和檸檬酸鹽利用等特征，腸球菌在其他奶酪的成熟和香氣發(fā)展中起重要作用。腸球菌已成功用作奶酪中的起子或輔助培養(yǎng)物，包括用于食品和其他膳食補(bǔ)充劑[9]。 目前細(xì)菌素作為食品防腐劑的應(yīng)用主要集中在乳酸菌，包括乳球菌、乳酸桿菌、小球菌、明串珠菌產(chǎn)生的細(xì)菌素。有關(guān)腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用研究較少。腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素通常稱為腸球菌素，可抑制一些食源性病原體，如單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、肉毒梭菌、分枝桿菌、大腸埃希菌和粘球菌[10-13]的生長(zhǎng)。考慮到特定的腸毒素可能具有獨(dú)特的特性和抗菌潛力，分離新的細(xì)菌素將是十分必要的。本研究從不同食品中篩選產(chǎn)生腸毒素的腸球菌，為其在食品保鮮中的潛在應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?指示菌株和生長(zhǎng)條件

植物乳桿菌ATCC 8014作為指示菌進(jìn)行食物分離株篩選，存儲(chǔ)于20%甘油的Lactobacilli DeMann，Rogosa and Sharpe （MRS）肉湯，-80℃?zhèn)溆?。平板劃線法接種指示菌在MRS瓊脂板并于30℃溫育過(guò)夜。單個(gè)菌落接種到MRS肉湯中，30℃溫育過(guò)夜。所得培養(yǎng)物用于接種軟瓊脂覆蓋物（0.75%）以檢測(cè)細(xì)菌素活性。

1.2?產(chǎn)細(xì)菌素的食物分離株的篩選

選擇乳制品、香腸、水果、發(fā)酵橄欖、生肉和生牛乳等19種不同的食品，采用軟瓊脂覆蓋法篩選細(xì)菌素產(chǎn)生菌[14]。0.1%蛋白胨水與食物以1∶10（w/v）系列稀釋，將系列稀釋液涂布在MRS瓊脂平板上，30℃下培養(yǎng)48h;制備指示菌。10mL的MRS軟瓊脂覆蓋在約有100個(gè)菌落的平板，30℃下培養(yǎng)24h，周圍有明顯的抑菌區(qū)的菌落被認(rèn)為是潛在的細(xì)菌素產(chǎn)生者。這些菌落在MRS瓊脂上分離，同時(shí)檢測(cè)革蘭氏反應(yīng)和細(xì)胞形態(tài)，存儲(chǔ)于20%甘油中-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3?抗微生物活性測(cè)定

草坪斑點(diǎn)試驗(yàn)[14]用于確定細(xì)菌素。過(guò)夜培養(yǎng)的分離株培養(yǎng)液離心（8 000×g、4℃、10 min），獲得無(wú)細(xì)胞上清液。10μL上清液涂布于MRS軟瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)18h，觀察抑制區(qū)的出現(xiàn)。為了排除噬菌體的可能性，從抑制區(qū)無(wú)菌切出一片瓊脂，0.1%蛋白胨水勻漿與MRS軟瓊脂混合，將其與指示菌隔夜培養(yǎng)混合，倒入培養(yǎng)皿，檢測(cè)噬菌斑的存在。

1.4?抗菌譜

所有食物分離株均接種于5 mL MRS肉湯中，30℃培養(yǎng)24h。其他革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌接種到5mL的肉湯中，37℃培養(yǎng)24h。10μL無(wú)細(xì)胞上清液（調(diào)節(jié)pH值6.5～7.0），點(diǎn)至過(guò)夜培養(yǎng)的軟瓊脂上，30℃培養(yǎng)24h，并記錄抑菌活性。共有14株廣譜抗菌活性的菌株被檢出，其中一株命名為RM1，其產(chǎn)生的細(xì)菌素命名為 Ent-RM1，由于其具有最廣譜的抗菌活性而被選出進(jìn)行下一步研究。

1.5?食物分離株的鑒定

根據(jù)16SrRNA基因序列分析鑒定食物分離株的種屬。使用DNA分離試劑盒（（DNeasy Tissue Kit）提取分離株的總DNA。通用寡核苷酸引物fD1（5-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3）和rD1 （5-CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA GGT GAT CCA GCC-3）擴(kuò)增16SrRNA基因[15]。Taq DNA聚合酶試劑盒（QIAGEN）用于聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)（PCR）。PCR反應(yīng)包括初始變性（在95℃下3min），30個(gè)變性循環(huán)（95℃ 1min）后、退火（52℃ 30s）和延伸（72℃ 2min），最后延伸（72℃ 10min）。所有的PCR反應(yīng)均在Techgene DNA熱循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA提取試劑盒（QIAGEN）純化，連接到pGEM-T Easy 載體中（Promega Corporation），化學(xué)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。二氧化硅旋轉(zhuǎn)柱（QIAGEN）從含氨芐青霉素（100mg/mL）的LB（Luria-Bertani）肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)獲得重組質(zhì)粒。用非限制性內(nèi)切酶Not I（New England Biolabs）消化重組質(zhì)粒。另外，使用T7終止子和SP6啟動(dòng)子引物，通過(guò)Plant and Microbe Genomics Facility對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。使用BLAST工具將獲得的基因序列與NCBI GenBank中的已知細(xì)菌序列進(jìn)行比較。最終的種屬鑒定僅基于具有97%最小相似性的最高得分查詢來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1.6?細(xì)菌素活性鑒定

以1∶10將MRS軟瓊脂接種到指示菌隔夜培養(yǎng)物中，倒入培養(yǎng)皿，25°C放置10 min，再?gòu)闹甘九囵B(yǎng)瓊脂中切出直徑為4 mm的孔。在0.1%蛋白胨水中制備了RM1無(wú)細(xì)胞上清液的2倍稀釋液，將其置于瓊脂井孔中（50mL）。無(wú)菌0.1%蛋白胨水作為對(duì)照組。30℃下隔夜培養(yǎng)，測(cè)量并記錄井壁周圍的抑制區(qū)。以顯示指示劑草坪的清晰抑制區(qū)的最高稀釋度的倒數(shù)，乘以因子20以獲得AU / mL的任意活性單位測(cè)量細(xì)菌素滴度[10]。

1.7?酶和熱處理的影響

過(guò)夜培養(yǎng)的分離株RM1無(wú)細(xì)胞上清液（1mL）用以下酶（終濃度1μg/ mL）37℃處理2h：在20mmol/L Tris-HCl中的α-胰凝乳蛋白酶，pH 8.0;胃蛋白酶在0.002N HCl中;脂肪酶在0.1mmol/L磷酸鉀中，pH 6.0;木瓜蛋白酶在0.05mmol/L磷酸鈉中，pH 7.0;胰蛋白酶在40mmol/L Tris-HCl中，pH 8.2;蛋白酶在20mmol/L Tris-HCl中，pH 7.8;蛋白酶K和無(wú)花果苷在20mmol/L磷酸鈉，pH 7.0中。未經(jīng)處理的無(wú)細(xì)胞上清液作為陽(yáng)性對(duì)照。草坪斑點(diǎn)法測(cè)定Ent-RM1經(jīng)熱處理后的活性，即RM1無(wú)細(xì)胞上清液（1mL）在100℃靜置5、10、30min后，觀察其活性。

1.8?不同pH值下的穩(wěn)定性

用1mmol/L HCl或1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)無(wú)細(xì)胞上清液的pH值，室溫下培養(yǎng)1h，再將上清液調(diào)至中性pH值，用草坪斑點(diǎn)試驗(yàn)測(cè)定Een-RM1在不同pH值（pH 3.0、7.0、9.0）下的穩(wěn)定性。未調(diào)節(jié)pH值的無(wú)細(xì)胞上清液為對(duì)照。

1.9?Ent-RM1粗提

分離株RM1隔夜培養(yǎng)液5mL轉(zhuǎn)至1 000 mL新鮮MRS肉湯中，30℃培養(yǎng)24h，4℃離心（12 000×g，15 min）后，硫酸銨加入無(wú)細(xì)胞上清液中至60%的飽和，4℃溫和攪拌過(guò)夜。經(jīng)4℃離心（12 000×g，30 min）后，懸浮于50 mL磷酸鉀緩沖液（PBS，50mmol/L，pH 6.5）中。在4℃下，用1 kDa截留膜透析管對(duì)1 000 mL磷酸鉀緩沖液（100 mm，pH 7.0）進(jìn)行透析，共4次。命名為CE-RM1剩余的溶液（∽20 mL）通過(guò)0.2mm孔徑的低蛋白結(jié)合濾器（Millipore Corp.）滅菌，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.10?CE-RM1的活性量化

以商品Nisin為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定CE-RM1的相對(duì)活性[10]。Nisin溶于蒸餾水（目標(biāo)濃度為1 000 IU/mL），1mol/L HCl調(diào)節(jié)到pH 2.0，在121 oC滅菌15 min。將濃度分別為100、50、12.5、6.25、3.13 IU/mL的Nisin （5mL）接種于63孔MSR軟瓊脂上。同時(shí)點(diǎn)樣5μL CE-RM1，30℃下培養(yǎng)24h，觀察抑制區(qū)并測(cè)量其直徑，構(gòu)建劑量反應(yīng)圖，用以確定CE-RM1的Nisin等效單位。

1.11?分子量評(píng)估

采用16%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），對(duì) Ent-RM1的分子量進(jìn)行了初步分析評(píng)估。使用預(yù)染色的低范圍分子量蛋白質(zhì)標(biāo)記物作為大小參考[16]。10μL CE-RM1加載到凝膠上，電泳后分離這兩組泳道。通過(guò)用考馬斯藍(lán)固定和染色，一半凝膠用于分子量測(cè)定。另一半通過(guò)在20%（v / v）異丙醇和10%（v / v）乙酸中連續(xù)固定（30min/次），蒸餾水中洗滌，并室溫保持過(guò)夜，測(cè)定抗微生物活性，即用MRS軟瓊脂覆蓋洗過(guò)的凝膠，30℃下培養(yǎng)18h，觀察蛋白質(zhì)條帶周圍抑制區(qū)。

1.12?CE-RM1在牛乳中的抗菌性能

在市售滅菌牛乳中接種單核細(xì)胞增生李斯科特ScottA和蠟樣芽孢桿菌ATCC 121778檢測(cè)以CE-RM1的抗菌性。在已經(jīng)接種了致病菌（103 CFU/mL）的9mL牛乳中加入1mL CE-RM1，35oC培養(yǎng)24 h，同時(shí)以沒(méi)有加CE-RM1的接種液作為對(duì)照。在選定的時(shí)間點(diǎn)，將接種的牛乳在0.1%蛋白胨水中連續(xù)稀釋并涂布在TSA平板中，以確定CE-RM1對(duì)牛乳中病原體生長(zhǎng)的影響。35℃溫育24～48h以計(jì)數(shù)存活者（CFU/mL）。

1.13?超高壓處理（HPP）和CE-RM1聯(lián)合作用對(duì)大腸桿菌K12的滅活

離心（12 000×g、4℃、10min）后收集靜止期（109CFU / mL）的大腸桿菌K12細(xì)胞（25mL），25mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，12.5mol/L，pH 7.2）洗滌2次，懸浮于25mL PBS中。將細(xì)胞懸液（900μL）與PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）混合，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至無(wú)菌聚乙烯袋，熱密封。在含有1∶1（v / v）乙二醇的高壓處理器（Quintus QFP-6，F(xiàn)low Pressure Systems）中將樣品袋在500MPa和25±2℃下加壓1min水壓傳輸液（Houghto-Safe 620 TY）。此外，含有PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）的樣品用作對(duì)照，冰上備用。將所有樣品在0.1%蛋白胨水中連續(xù)稀釋并涂布在TSA上，37℃培養(yǎng)24～48h以計(jì)數(shù)存活者（CFU/mL）。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2?結(jié)果與分析

2.1?具有抗菌活性的分離物的分離和鑒定

共有51株菌被分離，這些從食品中分離的菌株均為非孢子革蘭氏陽(yáng)性球菌。其中14株分離菌株分別命名為 3E1、 3E2、 3E3、 3E4、 3E5、 3E6、5B1、6F2、6F3、15I2、16D1、16D2、B1和RM1，對(duì)食源性病原菌單核細(xì)胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌具有抗菌活性（表1）。此外，使用草坪斑點(diǎn)試驗(yàn)法檢測(cè)抗微生物特性，表征顯示抑菌圈為細(xì)菌素的作用而非噬菌體所致?；?6S rRNA基因序列分析，這14株分離菌株均被鑒定為腸球菌屬（Enterococcus spp.）。14株分離株產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的能力。其中，具有最廣譜的抗菌活性的分離株RM1被鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），有研究報(bào)道，非食物系統(tǒng)中糞腸球菌的高流行率是各種食物中天然微生物群的普遍成員[1，17-18]。

2.2?Ent-RM1的特性

Ent-RM1對(duì)指示菌顯示出強(qiáng)的抗菌滴度（1 280AU/ mL），其活性對(duì)熱和各種酶處理的敏感性見(jiàn)表2。100℃處理10min后，Ent-RM1的抗微生物活性仍然保留，表明其相對(duì)熱穩(wěn)定性。但活性在100℃熱處理20min完全消失。此外，Ent-RM1在很寬的pH內(nèi)都很穩(wěn)定。與Nisin不同，其溶解度和活性隨pH值的增加而降低，直至活性完全消失[19]，Ent-RM1在室溫下培養(yǎng)1h后在3.0～9.0的pH范圍內(nèi)仍保持其活性。Ent-RM1對(duì)蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感，表明其蛋白質(zhì)特性，部分活性在胰蛋白酶處理下丟失，揭示其抑制作用的亞態(tài)的蛋白質(zhì)性質(zhì)。對(duì)脂肪酶的抗性表明Ent-RM1不需要脂質(zhì)部分用于活性。綜上所述，Ent-RM1可能是巴氏殺菌、酸性或堿性食品或食品中潛在的添加劑。由草坪斑點(diǎn)法及細(xì)胞上清液中產(chǎn)生的抗菌活性顯示，Ent-RM1既可在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生，也可以在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生，原因是一方面細(xì)菌素在產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株表面所必需的吸附作用;另一方面，產(chǎn)生菌與指示菌之間必須進(jìn)行物理接觸，才能誘導(dǎo)細(xì)菌素的產(chǎn)生。這些控制系統(tǒng)可以節(jié)省細(xì)菌細(xì)胞的能量。

2.3?Ent-RM1相對(duì)活性值

為了量化CE-RM1的活性，使用商業(yè)Nisin作為參考標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定相對(duì)細(xì)菌活性值。由圖1可知，測(cè)量CE-?RM1的抑制區(qū)直徑為16 mm，與標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)圖中的類似點(diǎn)相匹配，確定CE-RM1的當(dāng)量濃度為44.7 IU /mL。

2.4?Ent-RM1分子量評(píng)估

通過(guò)16%Tris-tricine SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，Ent-RM1的分子量約為4.0k～4.5kDa（圖2泳道C）。因?yàn)橥ㄟ^(guò)SDS-PAGE測(cè)定值是近似的，故該分子量是估計(jì)值。

2.5?食源性病原體的滅活

圖3結(jié)果表明，處理1h后，單核細(xì)胞增生李斯特菌Scott A的群體降低至檢測(cè)限（101CFU / mL）以下，顯示Ent-RM1具有針對(duì)該病原體的殺菌作用（圖3A）。CE-RM1抑制芽孢桿菌ATCC 11778生長(zhǎng)的結(jié)果見(jiàn)圖3B，在整個(gè)培養(yǎng)期間該病原體的沒(méi)有明顯生長(zhǎng)，表明Ent-RM1具有針對(duì)蠟狀芽孢桿菌的抑菌作用。

2.6?HPP與CE-RM1的協(xié)同效應(yīng)

為了滅活革蘭氏陰性細(xì)菌，用HPP和CE-RM1協(xié)同對(duì)大腸桿菌K12進(jìn)行處理（圖4）。用HPP單獨(dú)處理或者CE-RM1單獨(dú)處理大腸桿菌K12沒(méi)有顯著差異，表明單獨(dú)的Ent-RM1對(duì)該革蘭氏陰性細(xì)菌沒(méi)有抗菌活性，可能是由于外膜的屏障特性[20]。雖然革蘭氏陰性菌的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白孔蛋白允許600 Da以下的親水分子自由擴(kuò)散，但 Ent-RM1太大（4.0k～4.5 kDa），無(wú)法橫穿外膜[12]，因此，Ent-RM1不能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜，大多數(shù)細(xì)菌素所攻擊的靶標(biāo)[7]。CE-RM1與HPP組合導(dǎo)致大腸桿菌K12明顯失活，與對(duì)照（未經(jīng)任何處理）相比平均群體減少5.5log，而僅由HPP引起3.0log減少，表明HPP和Ent-RM1有協(xié)同抗微生物的作用。由于革蘭氏陰性菌的外膜被認(rèn)為是由于HPP后外膜蛋白的變性而受損，因此，Ent-RM1可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞的致死性[11]。

3?結(jié)論

本研究中，51株可產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌從不同的食物中分離出來(lái)。采用草坪班點(diǎn)法，對(duì)14株對(duì)食源性病原菌（單核細(xì)胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌）具有抗性的食物分離株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，這14株分離株均被鑒定為腸球菌屬，其中從牛乳中分離出一株具有廣譜抗菌活性并且具有很強(qiáng)的抗菌活性的菌株進(jìn)行研究。通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)⒋诵路蛛x的食源性菌株鑒定為腸球菌（Enterococcus faecalis），并命名為菌株RM1，其產(chǎn)生的細(xì)菌素被命名為Ent-RM1。雖然腸球菌在奶酪中的使用備受爭(zhēng)議，如南歐一些國(guó)家用腸球菌作為起子發(fā)酵奶利用的是腸球菌對(duì)奶酪風(fēng)味的影響，而北歐一些國(guó)家卻持反對(duì)意見(jiàn)，但一些研究表明，食物分離株腸球菌對(duì)于傳統(tǒng)奶酪的成熟和香味的形成具有積極的作用[21]。同時(shí)，腸球菌能夠抑制食源性病原菌，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜菌等的生長(zhǎng)。細(xì)菌素的功效常受到食物生態(tài)系統(tǒng)中食物組成等條件的影響[22]。本研究對(duì)Ent-RM1在接種到牛乳中的食源性病原菌進(jìn)行的抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸球菌RM1對(duì)牛乳中的單核細(xì)胞增生李斯特菌具有快速殺菌活性，對(duì)蠟狀芽孢桿菌具有抑菌作用;同時(shí)，Ent-RM1在高達(dá)100℃和較寬pH范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性，使其可以作為天然防腐劑或食品添加劑用于食品中控制細(xì)菌污染，以提高產(chǎn)品的保質(zhì)期。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）