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        植物乳桿菌LPL10的體外益生特性研究

        2019-06-11 05:31:42陳瓊甘祥武黃魁英趙樂怡李學優(yōu)鮑志寧
        安徽農(nóng)業(yè)科學 2019年2期
        關(guān)鍵詞:抑菌耐酸

        陳瓊 甘祥武 黃魁英 趙樂怡 李學優(yōu) 鮑志寧

        摘要[目的]在篩選到一株食品源植物乳桿菌LPL10的基礎(chǔ)上,通過對其耐酸性、耐膽鹽、抑菌能力和產(chǎn)酸能力進行研究,確定其益生特性。[方法]采用平板活菌計數(shù)法測定LPL10的耐酸、耐膽鹽性能,通過抑菌圈法評價菌株的抑菌能力,高效液相色譜法測定LPL10發(fā)酵產(chǎn)有機酸能力。[結(jié)果]植物乳桿菌LPL10具有良好的低酸耐受能力,在pH 3.5條件下培養(yǎng)24 h活菌數(shù)為1.2×108 cfu/mL,存活率為148%;LPL10受0.1%膽鹽抑制影響較小,培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)為3.60×108 cfu/mL,存活率為356%;植物乳桿菌LPL10對指示菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和綠膿桿菌均有良好的抑制作用;LPL10發(fā)酵上清液中產(chǎn)的主要有機酸為乳酸和乙酸,相對含量分別為20.33、25.26 mg/L。[結(jié)論]體外益生特性研究表明,植物乳桿菌LPL10可以作為潛在的益生性菌株。

        關(guān)鍵詞植物乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;抑菌;產(chǎn)酸能力

        中圖分類號TS201.3文獻標識碼A

        文章編號0517-6611(2019)02-0156-03

        doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.047

        乳酸菌是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧生長細菌的總稱,它不僅能夠增強機體免疫力和抵抗力,還能防止部分胃腸道疾病的發(fā)生[1-3]。作為一種重要的乳酸菌,植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬,厭氧或兼性厭氧,該菌與其他乳酸菌的不同之處在于植物乳桿菌的活菌數(shù)比較高,能大量產(chǎn)酸,而且產(chǎn)出的酸性物質(zhì)能夠降解重金屬。植物乳桿菌常見于肉類、奶油及很多蔬菜發(fā)酵制品中,能通過胃并定植于腸道發(fā)揮益生作用,諸如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、對致病菌有抑制作用、降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病、緩解乳糖不耐癥等。植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑,可抑制人或動物體內(nèi)常見的致病菌,在食品、飼料等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。要發(fā)揮益生作用,益生菌必須能夠耐受人體胃腸道中胃酸和膽汁等不良環(huán)境[4-7]。鑒于此,筆者以植物乳桿菌LPL10為研究對象,分別測定其耐酸耐膽鹽、抑菌及產(chǎn)酸特性,以期開發(fā)出1株潛在的益生性菌株。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1菌種。

        植物乳桿菌LPL10來源于農(nóng)家酸豆角(已通過生化試驗和16S rDNA序列分析方法鑒定);指示菌金黃色葡萄球菌SAU08、藤黃微球菌MLU02、綠膿桿菌PPY01來源于廣東省微生物種質(zhì)資源庫。

        1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基。

        膽鹽:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;有機酸標準品:Sigma;其他普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

        LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,pH 7.4,配制1 L,固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

        NA培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,pH 7.2~7.4,配制1 L,固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

        MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏8 g,酵母膏粉4 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸三氨2 g,乙酸鈉5 g,硫酸鎂200 mg,硫酸錳50 mg,吐溫80 g,pH 6.2±0.2,配制1 L,固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

        1.1.3主要儀器設備。顯微鏡:重慶奧特光學儀器有限公司;752N型紫外可見分光光度計:上海儀電分析儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學儀器有限公司;PHS-3C型pH計:上海儀電科學儀器股份有限公司;PCR儀:Bio-Rad公司;高效液相色譜儀:島津LA20液相色譜儀;低溫冷凍離心機:Eppendorf 5427 R。

        1.2方法

        1.2.1耐酸性能研究。用7 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基pH為2.5、3.0和3.5。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后(菌液中菌的活菌數(shù)為8.1×107 cfu/mL),以2%的接種量分別接種于pH 2.5、3.0和3.5的MRS培養(yǎng)基,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),并在0、2、24 h取樣,稀釋至合適梯度后涂布MRS培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后計算活菌數(shù)。對照普通MRS培養(yǎng)基中涂布后的菌落數(shù),計算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%,其中N0表示低pH的活菌數(shù),Nt表示普通MRS的活菌數(shù)。

        1.2.2耐膽鹽性能研究。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后(菌液中菌的活菌數(shù)為1.01×108 cfu/mL),以2%的接種量接種于膽鹽濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%的MRS培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng),并在0、2、24 h取樣,稀釋至合適梯度后涂布MRS培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后計算活菌數(shù)。以普通MRS中涂布后的菌落數(shù)為對照,計算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%,其中N0表示膽鹽培養(yǎng)基的活菌數(shù),Nt表示普通MRS的活菌數(shù)。

        1.2.3抑菌試驗。

        1.2.3.1指示菌菌懸液的制備。選取金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌為指示菌,將斜面培養(yǎng)的3種指示菌用4~5 mL生理鹽水洗脫下來,測其OD600并設置OD600=4.00±0.01。

        1.2.3.2試驗平板的制備。將3種指示菌培養(yǎng)基加熱融化并冷卻到40~50 ℃,然后按1 μL/mL的比例添加已調(diào)配好的指示菌菌懸液,搖勻;用滅過菌的移液管分別移取10 mL已調(diào)節(jié)好的各培養(yǎng)基到90 mm培養(yǎng)皿中,待其凝固后用滅過菌的打孔器(直徑2.7 mm)打孔;各孔加入5 μL植物乳桿菌發(fā)酵上清液,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察抑菌效果,并測量抑菌圈直徑[8]。

        1.2.4測定產(chǎn)酸能力。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后,以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液4 mL,離心取上清液,采用0.22 um過濾膜進行過濾。液相操作條件為Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm),線性梯度洗脫,進樣量20 uL,示差顯示器檢測,流動相5 mmol/L硫酸,流速為0.6 mL/min,柱溫65 ℃。采用面積外標法進行定量測定。

        2結(jié)果與分析

        2.1耐酸性試驗結(jié)果

        人體胃酸pH主要維持在2.0~3.0,益生菌通過口服進入腸道需經(jīng)過胃的酸性環(huán)境[8],因此耐酸性試驗選取3個pH,分別為2.5、3.0和3.5。由圖1和2可以看出,植物乳桿菌LPL10具有一定的耐酸能力。MRS培養(yǎng)基pH為2.5時,LPL10培養(yǎng)2 h活菌數(shù)依然保持在9.35×106 cfu/mL水平,但24 h后活菌數(shù)明顯降低,生長受到抑制;在培養(yǎng)基pH 3.0條件下,LPL10培養(yǎng)2和24 h后,活菌數(shù)都與初始菌數(shù)保持在同一數(shù)量級上,說明LPL10已能較好的耐受酸的影響,并保持一定的生長率;pH為3.5時,LPL10的生長已不受抑制,培養(yǎng)24 h存活率達到148%,顯示出良好的耐受性。

        2.2耐膽鹽試驗結(jié)果

        耐膽鹽試驗結(jié)果顯示(圖3和4),隨著培養(yǎng)基膽鹽濃度越高,LPL10存活率逐漸降低。在0.1%膽鹽濃度下LPL10的生長受膽鹽影響較小,培養(yǎng)2 h活菌數(shù)為1.39×108 cfu/mL,培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)增長至3.60×108 cfu/mL,存活率達356%;在0.3%膽鹽濃度下LPL10的生長已經(jīng)受到較大的抑制,培養(yǎng)24 h存活率為15.3%,但活菌依然維持在107 cfu/mL水平,LPL10雖受到抑制,但也維持一定的生長率。不同膽鹽濃度下發(fā)酵液pH及OD600與活菌數(shù)保持一致。

        2.3抑菌試驗結(jié)果

        采用打孔法對植物乳桿菌LPL10的抑菌能力進行測定,抑菌圈直徑越大,表示菌體的抑菌效果越好。試驗結(jié)果顯示,LPL10對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌均有一定的抑制作用,其中對綠膿桿菌的抑制效果最明顯,其抑菌圈直徑為6.49 mm。由于植物乳桿菌產(chǎn)酸也具有一定的抑菌效果,還需確定LPL10是否具有產(chǎn)細菌素功能。

        2.4產(chǎn)酸特性

        產(chǎn)酸是乳酸菌的一個重要益生特性,產(chǎn)何種酸與產(chǎn)酸能力強弱對乳酸菌的應用具有指導作用[9]。該試驗通過高效液相色譜法對LPL10發(fā)酵產(chǎn)有機酸能力進行了測定,圖5和6分別是有機酸標準品和LPL10發(fā)酵上清液液相圖。對兩者的有機酸出峰時間進行比較,結(jié)果顯示LPL10發(fā)酵上清液中主要有機酸為乳酸及乙酸,經(jīng)過計算其濃度分別為20.33、25.26 mg/L(表1)。

        3結(jié)論與討論

        植物乳桿菌是一種被廣泛應用于食品、發(fā)酵、青貯等方面的益生菌。隨著研究的深入,近年來植物乳桿菌也逐漸被用作腸道微生態(tài)改善制劑用于改善腸道微生態(tài)環(huán)境,因此對其各種益生能力的要求也逐漸提高。該研究中菌株LPL10為篩選于食品源的野生菌株,已經(jīng)過生理生化、16S rDNA鑒定確定為植物乳桿菌,并通過體外耐酸耐膽鹽、抑菌、產(chǎn)酸能力試驗,對該株菌的益生特性進行了初步研究。耐酸試驗中植物乳桿菌LPL10顯示出良好的耐酸能力,能夠耐受pH 3.5的酸性環(huán)境,但其在低酸環(huán)境中的穩(wěn)定性還不夠突出,后續(xù)還有較大的優(yōu)化空間。在0.1%的膽鹽濃度下,LPL10菌落的存活率達到100%以上。植物乳桿菌LPL10對常見的致病菌均有一定的抑制作用,其中對綠膿桿菌的抑制效果最明顯。液相檢測結(jié)果顯示,菌株具有良好的產(chǎn)酸能力。LPL10在體外試驗中顯示出了良好的益生潛力,后續(xù)可進一步優(yōu)化其相應特性。

        參考文獻

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