劉文靜,黃 彪,傅建煒*,韋 航,黃財標(biāo)
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室,福建省茶葉質(zhì)量檢測與技術(shù)推廣中心,福建 福州 350003)
中國是茶葉的生產(chǎn)、出口和消費大國,近年來關(guān)于茶葉尤其普洱茶、茯磚茶等發(fā)酵茶中真菌毒素污染已引起消費者的關(guān)注[1]。雖然茶葉加工過程干燥環(huán)節(jié)可能殺滅茶中的大多數(shù)微生物,但若包裝、貯藏不當(dāng),尤其茶葉吸濕受潮之后,仍可能受到真菌侵害并產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物[2]。陳年老茶亦稱年份茶,是指存儲一段時間后具有保健功能的茶葉,由于其需要存儲過程較長,存儲不當(dāng)將有可能導(dǎo)致茶葉發(fā)霉變質(zhì),產(chǎn)生毒素。迄今發(fā)現(xiàn)超過400 種真菌毒素[3],主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等,這些毒素對人體具有致畸、致癌、致突變、中毒性腎損害、肝細胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等慢性毒性[4-6]。有研究表明茶葉中主要污染的真菌毒素為黃曲霉毒素[7]、赭曲霉毒素[8]、伏馬毒素[9]、玉米赤霉烯酮[10]、T-2毒素[11]等。
目前,茶葉中真菌毒素的檢測方法主要包括薄層色譜法[12-13]、酶聯(lián)免疫法[14-15]、液相色譜法[9,16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與其他方法相比,定量更加準(zhǔn)確,選擇性和靈敏度也更高,已逐漸取代傳統(tǒng)的液相色譜方法應(yīng)用于茶葉中真菌毒素的檢測。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已建立了茶葉的赭曲霉毒素[18-19]、黃曲霉毒素[20-21]和玉米赤霉烯酮[22-23]的檢測方法。但上述檢測方法均針對單一毒素進行檢測,而同時檢測不同茶葉中多類、多組分真菌毒素低污染殘留的分析方法鮮見報道,一些真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[11,24]、玉米赤霉烯酮[25]仍然以酶聯(lián)免疫法進行檢測,由于茶葉中多酚類物質(zhì)及其他次生代謝產(chǎn)物的干擾,酶聯(lián)免疫法存在假陽性結(jié)果,還需進行色譜確證[5]。QuEChERS(quick, easy, cheap,effective, rugged, and safe)技術(shù)是由化學(xué)家Lehotay和Anastassiadas于2003年提出[26],目前,根據(jù)真菌毒素和樣品基質(zhì)的理化特性,開發(fā)多真菌毒素的QuEChERS技術(shù)正逐漸成為真菌毒素研究領(lǐng)域的熱點[27]。本實驗針對茶葉中可能出現(xiàn)的16 種真菌毒素收集不同茶葉生產(chǎn)廠家的陳年老茶為研究對象,建立QuEChERS技術(shù)進行前處理,利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定陳年老茶中16 種真菌毒素的方法,以期為陳年老茶的安全衛(wèi)生分析提供技術(shù)參考。
陳年老茶購自福建省各茶葉店、茶廠。烏龍茶38 份:其中2005—2010年間存儲茶葉樣品16 份,2011—2015年間存儲的樣品17 份,2016—2018年間存儲的樣品5 份。白茶53 份:其中1993—2010年間存儲茶葉樣品16 份,2011—2015年間存儲的樣品18 份,2016—2018年間存儲的樣品19 份。紅茶30 份:2004—2010年間存儲茶葉樣品12 份,2011—2015年間存儲的樣品11 份,2016—2018年間存儲的樣品7 份。茶葉粉碎后貯藏于馬口鐵茶葉罐中。
16 種毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%):伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、桔青毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素,上述16 種標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Romer公司。
QuEChERS提取鹽包(4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物)、dSPE凈化管(150 mg硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18、7 mg GCB)、Oasis PRIME HLB小柱(3 mL,150 mg)、Oasis HLB凈化柱(6 mL,150 mg)、甲酸(質(zhì)譜純)美國Waters公司;PriboFast?Multi-Toxin IAC多毒素免疫親和柱 中國Pribolab公司;Mycosep 226柱(AflaZon+Multifunctional Coumns, 25 per pkg) 美國Romer Labs公司;GHP濾膜(0.2 μm) 美國頗爾公司。
甲醇、乙腈(均為質(zhì)譜純) 德國Merck公司;超純水(實驗室一級水)由Millipore超純水機制備。
UPLC H-Class超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7 μm) 美國Waters公司;TDL-5-A型低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器公司;Direct-Q?3UV型純水儀中國密理博有限公司 。
1.3.1 茶葉樣品處理
茶葉樣品粉碎后過篩至粒度250 μm備用,每份樣品量需大于1 kg,稱取5 g茶葉樣品裝入50 mL離心管中,加入10 mL水和10 mL甲酸-乙腈(10∶90,V/V)溶液置于自動振蕩器中振搖10 min。加入QuEChERS提取鹽包,振搖1 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液進行待凈化。安裝Oasis PRIME HLB小柱,取約0.5 mL上清液通過Oasis PRIME HLB小柱,棄去濾液,然后再取1 mL上清液,再次通過小柱并收集濾液。將濾液移到含有混合吸附劑的dSPE凈化管中,10 000 r/min離心10 min,濾液過0.2 μm濾膜,待上機進樣。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制:將16 種真菌毒素分別用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-20 ℃以下避光保存,根據(jù)后續(xù)實驗需要,各取不同體積毒素儲備液配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液置于10 mL棕色儲液瓶中,避光備用。
1.3.3 色譜條件
色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3C18柱,柱溫40 ℃;樣品溫度15 ℃,進樣體積2 μL,分析時間8 min;流速0.4 mL/min;流動相A:0.1%甲酸溶液,流動相B:甲醇;梯度洗脫程序:0~0.5 min,98% A,2% B;0.5~5.0 min,98%~5% A,2%~95% B;5~8 min,5%A,95% B;8.0~8.01 min,5%~98% A,95%~2% B;8.01~10 min,98% A,2% B。
1.3.4 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源,正離子模式;檢測方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式;毛細管電壓1.5 kV;錐孔氣流:氮氣,流速50 L/h;離子源溫度1 2 0 ℃;脫溶劑氣溫度5 0 0 ℃,流量1 000 L/h;碰撞氣:高純氬氣。
根據(jù)16 種真菌毒素分子的化學(xué)電離性質(zhì),分別在電噴霧離子源正/負模式下采用全掃描模式方式選擇母離子、子離子掃描模式對子離子及碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)所有毒素在正離子模式下響應(yīng)值均高于負離子模式,最終確定16 種真菌毒素的母離子、定性離子和定量離子參數(shù),見表1。伏馬毒素B2與伏馬毒素B3,離子通道相接近,保留時間分別在5.22 min和3.03 min可以有效分離,其余化合物在各自的離子通道下不存在相互干擾,符合歐盟2002/657/EC號決議《質(zhì)譜分析方法鑒定點數(shù)》中對待測物定性及定量的要求。
表1 不同真菌毒素檢測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 mycotoxins
分別選擇甲醇-純水和乙腈-純水作為洗脫流動相,比較2 個流動相體系對分離效果的影響。實驗表明:以甲醇-純水為流動相時,黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1的響應(yīng)值顯著降低;乙腈-純水為流動相時,伏馬毒素B2、伏馬毒素B3無法完全分離??梢娨约兯鳛榱鲃酉鄷r,離子化效率較差,靈敏度低。為增強各組分物質(zhì)離子化強度,本實驗在水溶液種添加甲酸(終體積分數(shù)分別為0.1%)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入0.1%甲酸溶液有利于抑制真菌毒素與色譜柱的靜電作用,避免拖尾現(xiàn)象,伏馬毒素峰形對稱性明顯得到改善;并可以增強黃曲霉毒素的響應(yīng)值。因此本實驗最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相時,16 種毒素的色譜峰形和響應(yīng)強度均理想,保留時間穩(wěn)定,離子通道相接近的伏馬毒素B2與伏馬毒素B3可以充分分離。色譜條件優(yōu)化后的真菌毒素總離子流色譜圖如圖1所示。
圖1 真菌毒素總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of mixture of 16 mycotoxins
在實驗過程中,提取溶劑的選擇直接影響回收率的高低,為了獲得盡可能高的回收率,必須選擇提取效率高的溶劑。本實驗比較了乙腈、甲醇作為提取溶劑,實驗發(fā)現(xiàn)甲醇作為質(zhì)子化溶劑相比乙腈具有更好的溶解性,但易將茶葉中的酸、醇、酚類物質(zhì)提取出來而導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)較多;乙腈提取液相比甲醇提取液的脂肪和色素較少,有利于后續(xù)步驟的鹽析和凈化,最終選擇乙腈作為提取溶劑。
部分毒素含羧基基團,對提取溶劑中酸度敏感,因此添加甲酸到提取溶劑中可以增強伏馬毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集團毒素的穩(wěn)定性及回收率。從表2可知,提取溶劑中的甲酸含量對不同種類毒素回收率的影響不同,其中,4 種黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素和鐮刀菌烯醇受甲體積分數(shù)度變化的影響較?。黄溆?0 種毒素均隨提取劑中甲酸濃度的增加而增加,但是當(dāng)提取劑中甲酸體積分數(shù)達15%時,雪腐鐮刀菌烯醇、桔青毒素、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素的回收率下降,且與甲酸體積分數(shù)10%時相比達差異顯著水平(P<0.05)。因此本實驗選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑。
表2 16 種真菌毒素在不同甲酸含量提取劑下的回收率Table 2 Recoveries of 16 mycotoxins extracted by acetonitrile with different formic acid concentrations
采用Oasis PRIME HLB凈化柱第一步凈化,可以有效去除茶葉中大分子脂類雜質(zhì),再通過dSPE凈化管,凈化管含硫酸鎂成分可去除基質(zhì)中水分,PSA去除茶葉基質(zhì)中的糖類和酸性成分,C18主要吸收剩余殘留脂類成分,GCB主要去除茶葉中色素成分,應(yīng)用上述凈化方法可以達到滿意回收率效果。本實驗以烏龍茶提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液比較多毒素免疫親和柱[28]、Mycosep 226柱[29]、Oasis HLB凈化柱和Oasis PRIME HLB凈化柱,結(jié)果如表3所示,多毒素免疫親和柱可測的毒素種類不能覆蓋全部待測的16 種毒素,且前處理較為復(fù)雜,回收率低;Mycosep 226柱凈化對黃曲霉毒素G2和玉米赤霉烯酮回收率較低,去除色素效果也不理想;Oasis HLB小柱凈化效果不理想,并對毒素有吸附作用,導(dǎo)致回收率低,達不到實驗要求。因此本實驗采用Oasis PRIME HLB凈化柱結(jié)合dSPE凈化管方法可以降低茶葉復(fù)雜基質(zhì)對毒素提取的干擾,達到凈化效果。
表3 4 種凈化柱對16 種真菌毒素回收率的影響Table 3 Effects of 4 purification columns on the recoveries of 16 mycotoxins
圖2 16 種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 2 Matrix effects of 16 mycotoxins
以不含毒素的烏龍茶、紅茶、白茶作為基質(zhì)空白,采用相同處理方法加入毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和流動相溶液,利用二者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評價不同茶葉基質(zhì)對毒素的基質(zhì)效應(yīng),比值一般在0.8~1.2定為基質(zhì)效應(yīng)不明顯,當(dāng)比值大于1.2視為基質(zhì)增強效應(yīng),比值小于0.8視為基質(zhì)抑制效應(yīng)[30],測定結(jié)果如圖2所示,3 類茶葉中伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、HT-2毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇基質(zhì)效應(yīng)均大于1.2,增強效應(yīng)的毒素種類約占31.3%,因此必須去除茶葉的基質(zhì)干擾。本實驗采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行校準(zhǔn)定量,根據(jù)成分補償基質(zhì)效應(yīng),提高實驗回收率水平。
依據(jù)樣品中16 種毒素基質(zhì)效應(yīng)強弱,配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以不同種茶葉空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品母液,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。按照1.3.3節(jié)條件進樣分析,以各組分的峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),分別繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)不同,將配制好的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到茶葉樣品進行處理進樣,根據(jù)真菌毒素在不同茶葉基質(zhì)中最低添加濃度計算本方法的檢出限,根據(jù)茶葉基質(zhì)標(biāo)曲的最低點確定本方法的定量限。結(jié)果顯示,16 種真菌毒素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在各自范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。由表4可知,方法檢出限在0.03~7.00 μg/kg之間,其中,黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的檢出限和定量限均低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量中的指標(biāo)》[31]。
表4 真菌毒素的線性方程、檢出限和定量限(n=6)Table 4 Linear equations, LODs and LOQs of 16 mycotoxins in tea (n= 6)μg/kg
由于不同種類茶葉的基質(zhì)效應(yīng)具有一定的差別,因此茶葉中不同種類真菌毒素的定量限不同。本實驗根據(jù)真菌毒素在不同種類茶葉中定量限,設(shè)計低、中、高3 個水平進行加標(biāo)回收率實驗,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。如表5所示,16 種真菌毒素的加標(biāo)回收率為63.4%~109.7%,RSD為1.7%~11.3%,說明本實驗方法滿足實驗要求。
表5 不同種類茶葉的加標(biāo)回收率及精密度(n=3)Table 5 Recoveries and precision of 16 mycotoxins spiked into different tea samples (n= 3)
續(xù)表5
檢測福建省各地區(qū)共計121 份陳年老茶樣品(烏龍茶38 份、白茶53 份、紅茶30 份),其中1 份烏龍茶樣品檢出黃曲霉毒素B1,含量為34.0 μg/kg,參考GB 2761—2017的限量標(biāo)準(zhǔn)(5.0~20.0 μg/kg)超過限量值[31],1 份紅茶樣品檢出赭曲霉毒素A,含量為1.6 μg/kg,參考GB 2761—2017的標(biāo)準(zhǔn)(5.0 μg/kg)未超限量值[31]。陳年老茶貯藏年份較長,放置環(huán)境發(fā)生變化或包裝損壞都可能導(dǎo)致茶葉受到真菌污染從而產(chǎn)生毒素危害人類健康。
本實驗建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同種類陳年老茶中16 種真菌毒素的方法。樣品經(jīng)甲酸-乙腈(10∶90,V/V)溶液提取,加入QuEChERS鹽包振搖離心,提取液過OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管處理,以ACQUITY UPLC HSS T3C18色譜柱分離,采用電噴霧正離子模式掃描,MRM模式測定,茶葉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,外標(biāo)法定量。16 種真菌毒素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。采用QuEChERS方法提取結(jié)合OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管雙重凈化的前處理方法,成本遠低于目前普遍采用的免疫親和柱,操作更簡單,無需活化和平衡步驟,可除去大部分基質(zhì)干擾物,并且溶液流速更快,使得整個操作更順暢、更快速;采用高靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時測定16 種真菌毒素,提取時間短,20 min內(nèi)即可完成,極大的提高測試的通量;經(jīng)過優(yōu)化后方法16 種真菌毒素的檢出限達到0.03~7.00 μg/kg,靈敏度較高,能滿足產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督的要求。
QuEChERS是一種快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術(shù)[32],分為提取、鹽析和凈化3 個步驟,提取是QuEChERS技術(shù)重要的組成部分,提取液的提取效率決定著最終分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于極性范圍敏感的目標(biāo)樣品提取時,需在提取液中添加輔助試劑(乙酸、甲酸和甲醇等)以增強聯(lián)合提取的效果[33]。本實驗檢測發(fā)現(xiàn),在甲酸添加量為1%~10%范圍內(nèi),16 種毒素回收率的平均值呈上升趨勢,超過10%略有下降,因此選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑,使16 種真菌毒素均有較高的回收率。
本實驗在陳年老茶中檢出真菌毒素,說明陳年老茶存在真菌毒素污染的安全隱患,目前針對茶葉中毒素的限值還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),因此極有必要建立茶葉中的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)及檢測標(biāo)準(zhǔn)。