張麗妮，鄒 孝，余文琴，但家宇，唐加利，高亞凱

（1.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶 401121；2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

近年來，食品接觸材料遷移帶入的食品安全問題已經(jīng)引起了食品安全監(jiān)管部門的注意。這些食品接觸材料常使用的一些化學(xué)染料，如熒光增白劑，它在塑料材料中大量使用，是一種容易殘留并遷移到食品中的有毒有害物質(zhì)。據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)道，熒光增白劑可使細(xì)胞產(chǎn)生變異，會(huì)通過與接觸的食品遷移進(jìn)入人體或直接與人體表面皮膚接觸[1]。雖然食品接觸材料中批準(zhǔn)使用的適量熒光增白劑屬低毒風(fēng)險(xiǎn)，但違規(guī)添加及過量使用則會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，同時(shí)也是潛在的致癌因素之一[2-3]。我國GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)，歐盟2002/72/EC號(hào)指令及美國聯(lián)邦法規(guī)21CFR178.3297均制定了允許用于生產(chǎn)食品接觸材料和制品的熒光增白劑清單，同時(shí)還規(guī)定了最大使用量和特定遷移限量，如熒光增白劑FWA184，我國標(biāo)準(zhǔn)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)一致，均規(guī)定其特定遷移限量為0.6 mg/kg，美國聯(lián)邦法規(guī)則規(guī)定其加入量不得超過0.015%[4-7]。

目前，關(guān)于洗滌用品、紡織用品、塑料制品中熒光增白劑的檢測(cè)技術(shù)多有報(bào)道[8-9]，國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)熒光增白劑的研究主要有紫外分光光度法[10]、熒光光度法[11-12]、高效液相色譜法和超高效液相色譜法[13-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-29]等。紫外分光光度法和熒光分光光度法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作易行、檢測(cè)速率較快，但是干擾因素多、靈敏度不高，只能測(cè)定單一熒光增白劑或熒光增白劑總量，無法分析具體種類，而且環(huán)境因素對(duì)結(jié)果有影響；高效液相色譜法是目前技術(shù)相對(duì)成熟的一種檢測(cè)手段，對(duì)于較為復(fù)雜的基質(zhì)易受雜質(zhì)干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性難以保證，且在分析多化合物時(shí)，不易分離或者分析時(shí)間過長；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則是結(jié)合了液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，通過保留時(shí)間與特征離子對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性與定量分析，具有其他分析方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于復(fù)雜化合物的定性定量更為準(zhǔn)確，因此，近些年學(xué)者開始研究開發(fā)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品接觸材料多種熒光增白劑的檢測(cè)方法。如呂水源等[30]建立了高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定塑料食品接觸材料中OB、OB-1、EBF、KCB 4 種熒光增白劑含量的檢測(cè)方法；許健等[31]建立了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)泡聚苯乙烯餐具中FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 8 種熒光增白劑的含量。

雖然超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定塑料食品接觸材料中熒光增白劑已有報(bào)道，但目前仍沒有超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定塑料食品接觸材料中熒光增白劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，前人在研究時(shí)存在一些不足，一是研究選擇的材質(zhì)比較單一，二是對(duì)于多種熒光增白劑同時(shí)檢測(cè)的論述較少。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以市場(chǎng)上常見的食品接觸材料為對(duì)象，在提取溶劑選擇和色譜條件優(yōu)化方面進(jìn)行了大量的工作，以期建立一種適合多種塑料食品接觸材料材質(zhì)中9 種熒光增白劑同時(shí)檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，為市場(chǎng)監(jiān)管部門調(diào)查食品接觸材料中的熒光增白劑含量提供技術(shù)支持，同時(shí)也為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塑料食品接觸材料樣本購自本地超市、甜品店、飯店；FWA199、FWA135、FWA378標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；FWA184、FWA52、FWA393 標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 北京百靈威科技有限公司；FWA367標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 英國Fluorochem化學(xué)有限公司；FWA185、FWA368對(duì)照品（純度＞95%） 濟(jì)南塑邦精細(xì)化工有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 成都科隆化學(xué)品有限公司；乙酸銨（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；三氯甲烷（分析純） 重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC 1290/API 4000型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）） 美國Agilent公司/美國Sciex公司；Quintix224-1CN電子天平 德國Sartorius公司；PP020XXM1&PF2XXXXM1超純水機(jī) 英國Elga公司；VORTEX3旋渦混合器 德國IKA公司；3K15離心機(jī)德國Sigma公司；KH5200DE超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；MD200-2氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACOUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相；A為0.1%甲酸-乙腈溶液，B為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；碰撞氣（N2）壓力6 psi；氣簾氣（N2）壓力30 psi；霧化氣（N2）壓力60 psi；輔助加熱氣（N2）壓力60 psi；碰撞室出口電壓14 eV。監(jiān)測(cè)離子對(duì)、定量離子、去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2 9 種熒光增白劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for nine fluorescent whiteners

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃保存；將FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA367配成混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋為線性范圍0.5～100 ng/mL，將FWA199、FWA368、FWA378、FWA393配成混和標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇逐級(jí)稀釋為線性范圍5～1 000 ng/mL。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品處理

選取食品接觸類塑料包裝，如：飲用水瓶（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET））、密胺餐具（密胺樹脂（melamine resin，MF））、一次性餐盒（聚丙烯（polypropylene，PP））、方便面桶（聚乙烯（polyethylene，PE）內(nèi)膜）、復(fù)合膜包裝袋（雙向拉伸尼龍/低密度聚乙烯（biaxially oriented polyamide(nylon) film/low-density polyethylene，BOPA/LDPE）復(fù)合）、鍍層塑料包裝（CPP鍍鋁膜）6 種材質(zhì)17 個(gè)代表性樣品，剪成小于5 mm×5 mm的碎片，混勻后分別裝入潔凈容器作為試樣，密封并做標(biāo)識(shí)。

樣品前處理：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）已混勻的樣品于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入10 mL三氯甲烷，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至氮吹管中，繼續(xù)加入10 mL甲醇至比色管中，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移并合并2 次提取的上清液，于40 ℃氮吹至近干，殘?jiān)?.0 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定。

加標(biāo)樣品制備：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）經(jīng)前期檢測(cè)為陰性的試樣于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫放置，待樣品吸收標(biāo)液至干后，按上述步驟進(jìn)行前處理。

1.3.5 提取溶劑選擇

本實(shí)驗(yàn)以提取回收率為指標(biāo)，以6 種材質(zhì)為基質(zhì)，對(duì)甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）溶劑進(jìn)行比較研究，并確定合適的提取溶劑。

1.3.6 檢出限與定量限

按照1.3.4節(jié)樣品提取條件，以經(jīng)前期測(cè)試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，用陰性樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，以10 倍信噪比計(jì)算定量限。1.3.7 回收率與精密度

按照1.3.4節(jié)樣品提取條件，以經(jīng)前期測(cè)試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，取樣品0.5 g，分別添加定量限的1、2 倍和10 倍3 個(gè)水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，均扣除本底值后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用WPS 2019表格，圖像處理方法采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)熒光增白劑主要使用的流動(dòng)相通常為0.1%甲酸-乙腈（A）和水（B）[21]；0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸（B）[30]；乙腈（A）和乙酸銨緩沖溶液（B）[31]。實(shí)驗(yàn)在借鑒前人使用流動(dòng)相的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的9 種目標(biāo)熒光增白劑的分離效果不佳，峰形差。為了達(dá)到良好的分離效果和峰形，從流動(dòng)相pH值穩(wěn)定性和離子強(qiáng)度進(jìn)行改進(jìn)。對(duì)比研究0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）4 種流動(dòng)相組合。首先使用0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸（B）和0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸（B）作為流動(dòng)相時(shí)，分離度因個(gè)別峰的峰形寬及拖尾嚴(yán)重造成總離子流圖分離效果不佳，而后考慮加入5 mmol/L乙酸銨緩沖鹽使流動(dòng)相保持一定的離子強(qiáng)度以改善峰形，使用0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動(dòng)相時(shí)效果明顯，分離效果好、峰形好、響應(yīng)高，但檢測(cè)時(shí)間稍長，考慮到這9 種熒光增白劑的極性偏弱，選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動(dòng)相時(shí)，洗脫能力增強(qiáng)，9 種熒光增白劑的保留時(shí)間減少，經(jīng)過梯度程序優(yōu)化，同樣能達(dá)到很好的分離效果，響應(yīng)更高，尤其是FWA378、FWA367、FWA184，比0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動(dòng)相體系高3～5 倍。最終選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨（B）溶液作為流動(dòng)相，并優(yōu)化梯度洗脫程序。9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖見圖1。

圖1 9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms for chromatographic separation of nine fluorescent whiteners

2.2 提取溶劑的選擇

考慮到本實(shí)驗(yàn)的9 種目標(biāo)熒光增白劑屬于脂溶性熒光增白劑，提取溶劑需選擇有機(jī)溶劑。在前人的研究中，劉杰等[13]研究了三氯甲烷和甲醇對(duì)脂溶性熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）能夠兼顧回收率和峰形，吳鐘玲等[32]研究了甲醇、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF對(duì)脂溶性熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明三氯甲烷是最佳提取劑。葉玲等[33]比較研究三氯甲烷、甲醇、乙腈對(duì)熒光增白劑的提取效果，結(jié)果顯示三氯甲烷為最佳提取劑。本實(shí)驗(yàn)選取甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF為提取劑，在相同條件下（室溫超聲提取30 min，料液比0.5 g/10 mL），對(duì)6 種不同材質(zhì)的自制陽性樣品進(jìn)行測(cè)試，比較不同材質(zhì)食品接觸材料中熒光增白劑在不同提取溶劑中的提取效果，由圖2可以看出，和前人研究結(jié)果一致，三氯甲烷和甲醇對(duì)6 種材質(zhì)的食品接觸材料中熒光增白劑的提取效果均優(yōu)于其他試劑，但二者對(duì)不同的熒光增白劑有著不同提取效率，前人的研究以使用三氯甲烷為主，甲醇的作用多為沉淀高聚物以減少雜質(zhì)的干擾[31]，并沒有考慮甲醇對(duì)個(gè)別熒光增白劑的萃取作用。本實(shí)驗(yàn)在探索過程中發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)FWA52、FWA185、FWA368、FWA378的提取效果優(yōu)于三氯甲烷，劉杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷和甲醇作為提取溶劑時(shí)，甲醇含量超過三氯甲烷的1/4會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)熒光增白劑和高聚物一起析出，影響回收率，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試采用前人未曾摸索的兩種溶劑分兩步提取法，先用三氯甲烷超聲提取30 min，再用甲醇超聲提取30 min，合并2 次提取溶液，氮吹至近干后用1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)，圖3表明，分2 次提取6 種材質(zhì)食品接觸材料中的9 種熒光增白劑，雖然FWA52回收率較甲醇單獨(dú)提取有所降低，但9 種熒光增白劑整體回收率明顯優(yōu)于甲醇和三氯甲烷單獨(dú)提取的效果，說明三氯甲烷和甲醇分別提取熒光增白劑能夠起到互補(bǔ)作用。

圖2 提取溶劑對(duì)6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recovery of nine fluorescent brighteners in six food contact materials

圖3 甲醇、三氯甲烷、三氯甲烷和甲醇分2 次提取對(duì)6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 3 Effects of individual and sequential extraction with chloroform and methanol on on the recovery of 9 fluorescent whitening agents in six food contact materials

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化通過在流動(dòng)注射模式下對(duì)1.0 μg/mL的9 種熒光增白劑單獨(dú)進(jìn)樣完成。根據(jù)9 種熒光增白劑的化合物結(jié)構(gòu)，選擇在正離子模式下進(jìn)行優(yōu)化。采用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行母離子全掃描，分析得到[M+H]+分子離子峰；再采用二級(jí)質(zhì)譜，以分子離子為母離子，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量參數(shù)，對(duì)目標(biāo)化合物的子離子進(jìn)行全掃描，每種熒光增白劑選擇2 個(gè)信號(hào)穩(wěn)定且強(qiáng)度高的m/z為定性離子對(duì)，選著其中信號(hào)強(qiáng)度高且受基質(zhì)干擾小的m/z為定量離子對(duì)，結(jié)果見表2。9 種熒光增白劑提取離子色譜見圖4。

圖4 9 種熒光增白劑提取離子MRM色譜圖Fig. 4 Extracted ion MRM chromatograms of nine fluorescent whiteners

2.4 線性范圍、檢出限和定量限測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.3.3節(jié)方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)測(cè)試分析后得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用陰性樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算檢出限和定量限，結(jié)果見表3。9 種熒光增白劑在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9 9 9，檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，本方法線性范圍寬、靈敏度高。

表3 9 種熒光增白劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients,linear ranges, detection limits and quantitative limits for nine fluorescent brighteners

2.5 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表4 可知，9 種熒光增白劑的平均回收率在76.11%～106.55%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.97%～8.31%之間，表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

表4 9 種熒光增白劑的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of nine fluorescent brighteners from spiked samples (n= 6)

2.6 實(shí)際樣品分析結(jié)果

采用最優(yōu)條件下的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)從超市、甜品店、飯店購買的17 個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表5，圖5為典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖和質(zhì)譜圖。由表5可看出，有15 個(gè)樣品檢出不同程度的熒光增白劑，主要集中在FWA135、FWA184、FWA378、FWA393，F(xiàn)WA393最高檢出含量1 380 μg/kg，而FWA135、FWA184、FWA378并不允許在食品接觸用塑料材料及制品中使用，由此可見，檢出樣品可能是由于污染帶入，或者是人為在塑料制品中違規(guī)使用禁用熒光增白劑，需要市場(chǎng)監(jiān)管部門加強(qiáng)監(jiān)督管理。同時(shí)本課題在接下來的研究中會(huì)對(duì)特定遷移量的模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

表5 塑料食品接觸材料實(shí)際樣品中9 種熒光增白劑的含量Table 5 Contents of nine FWAs in actual samples of plastic food contact materials determined by the proposed method

圖5典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of fluorescent brightener (FWA393) in typical positive samples (YP-16)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定塑料食品接觸材料中FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 9 種熒光增白劑含量的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法條件下9 種熒光增白劑檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9 9 9，加標(biāo)回收率范圍為76.11%～106.55%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為1.97%～8.31%，均符合方法確認(rèn)的要求，本方法成功應(yīng)用于塑料食品接觸材料中9 種熒光增白劑的快速定性定量分析，為檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，同時(shí)為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。