門佳軒，熊 博，郝亞男，李 旋，劉益寧，謝希賢

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）是一種重要的藥品和食品化學(xué)品的中間體，參與合成動(dòng)物體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)與激素，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[1]。作為一種抗癌藥物的載體，L-Phe可將抗癌藥物導(dǎo)入腫瘤位置，在抑制腫瘤增長的同時(shí)又可大幅降低藥物毒副作用。此外，L-Phe也是低熱量甜味劑阿斯巴甜的主要合成原料。近年來，隨著腫瘤藥物及甜味劑阿斯巴甜的市場需求不斷增加，L-Phe供應(yīng)也在逐年增長[2]，這對(duì)L-Phe的工業(yè)生產(chǎn)提出了更高的要求。此前，L-Phe生產(chǎn)方法主要分為化學(xué)合成法、酶法以及微生物發(fā)酵法。近年來，由于化學(xué)合成法及酶法生產(chǎn)成本高昂、材料來源有限及環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，L-Phe主要生產(chǎn)方法已發(fā)展為相對(duì)經(jīng)濟(jì)環(huán)保的微生物發(fā)酵法[3]。微生物發(fā)酵法中產(chǎn)能主要取決于工程菌株的性能，高效的工程菌株可有效提高綜合產(chǎn)能并節(jié)約生產(chǎn)成本。然而，現(xiàn)有工程菌株普遍存在生產(chǎn)效率低下以及攜帶質(zhì)粒等問題，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，限制了規(guī)?；I(yè)應(yīng)用。因此，構(gòu)建1 株高效、無質(zhì)粒的L-Phe工程菌株意義重大。

隨著合成生物學(xué)及系統(tǒng)代謝工程等技術(shù)手段的發(fā)展，L-Phe的生物合成及代謝調(diào)控在大腸桿菌中得到廣泛研究。L-Phe合成途徑由中心代謝途徑、莽草酸途徑及分支途徑3 部分組成，常規(guī)L-Phe生產(chǎn)菌株構(gòu)建策略也主要集中在這3 個(gè)方面[4]。首先是解除雙功能酶PheA和3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP）合成酶AroG的反饋抑制并增強(qiáng)其表達(dá)。Backman等[5]在1 株酪氨酸缺陷菌株中通過質(zhì)粒過表達(dá)了解除反饋抑制的pheAfbr（抗反饋抑制）和aroFfbr基因，發(fā)酵36 h后，產(chǎn)量達(dá)50 g/L。其次是增強(qiáng)前體物赤蘚糖-4-磷酸（erythrose-4-phosphate，E4P）與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）的供應(yīng)。由于PEP分流十分明顯，大部分參與到磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（glucose phosphotransferase，PTS）系統(tǒng)的攝糖作用中[6]，因此多數(shù)研究都是利用其他酶代替PTS系統(tǒng)進(jìn)行糖的攝取[7-8]。而這種策略在節(jié)省大量PEP的同時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響菌體生長，因此不適于工程菌株的構(gòu)建。最后則是強(qiáng)化莽草酸途徑部分基因。Liu Yongfei等[9]在1 株L-酪氨酸缺陷型大腸桿菌中通過質(zhì)粒過表達(dá)了去反饋抑制的關(guān)鍵酶及3-脫氫奎寧酸脫水酶基因aroD，同時(shí)過表達(dá)大腸桿菌自身的半乳糖透性酶基因galP及葡萄糖激酶基因glk以代替失活的PTS系統(tǒng)，利用該菌株發(fā)酵52 h后，L-Phe產(chǎn)量達(dá)72.9 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.4 g/（L·h），是目前為止報(bào)道的L-Phe最高產(chǎn)量。

上述菌株的改造策略雖指導(dǎo)了后續(xù)L-Phe菌株的構(gòu)建，但與現(xiàn)有工程菌株一樣，由于上述菌株為缺陷型菌株且攜帶質(zhì)粒等問題，發(fā)酵過程中需要添加抗生素和缺陷型氨基酸以保證菌株穩(wěn)定生產(chǎn)，這些弊端無疑會(huì)增加工業(yè)生產(chǎn)的成本，降低產(chǎn)品在市場上的競爭力。此外，常規(guī)改造策略多是對(duì)雙功能酶PheA、DAHP合成酶、前體物供應(yīng)等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行改造，少有全面系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌中L-Phe代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化，這就可能導(dǎo)致代謝流至某一步反應(yīng)時(shí)發(fā)生阻塞，積累毒副產(chǎn)物，影響菌體生產(chǎn)。針對(duì)上述問題，本研究從大腸桿菌基因組水平出發(fā)，通過代謝工程技術(shù)手段，分模塊依次對(duì)L-Phe分支途徑、莽草酸途徑以及中心代謝通路進(jìn)行系統(tǒng)全面的優(yōu)化。首先，通過強(qiáng)化L-Phe合成支路獲得1 株能夠初步積累L-Phe的菌株；在此基礎(chǔ)上，對(duì)莽草酸途徑各基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化以確定最適表達(dá)量；最后，通過增強(qiáng)中心代謝途徑中前體物的供應(yīng)，獲得1 株穩(wěn)定高產(chǎn)、無質(zhì)粒的非缺陷型大腸桿菌L-Phe生產(chǎn)菌株（圖1）。

圖1 大腸桿菌L-Phe合成代謝路徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of L-phenylalanine in Escherichia coli

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

2×YT培養(yǎng)基：蛋白胨1.6 g/100 mL，酵母粉1 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL。

斜面培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1.5 mL/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 30 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

微量元素混合液：Na2MoO4·2H2O 2.5 g/L，AlCl3·6H2O 2.5 g/L，NiSO4·6H2O 2.5 g/L，CoCl2·6H2O 1.75 g/L，CaCl2·2 H2O 10 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5 g/L，CuCl2·2 H2O 0.25 g/L，H3BO30.125 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；UV 200II紫外-可見波長檢測器 美國Laballiance設(shè)備公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SBA-40C生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的構(gòu)建

利用規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術(shù)對(duì)菌株基因進(jìn)行改造，完成工程菌的構(gòu)建[10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個(gè)質(zhì)粒。pREDCas9質(zhì)粒主要由RED重組酶、Cas9蛋白及pGRB質(zhì)粒消除系統(tǒng)組成，含奇霉素抗性（質(zhì)量濃度100 mg/L、32 ℃培養(yǎng)）。pGRB質(zhì)粒主要由啟動(dòng)子、gRNA-Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域和終止子組成，含氨芐青霉素抗性（質(zhì)量濃度100 mg/L、37 ℃培養(yǎng)）。pGRB質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的gRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物并識(shí)別到靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)基因雙鏈斷裂[11]。同時(shí)，目的DNA片段在重組酶作用下與斷裂雙鏈發(fā)生同源重組從而被整合在基因組上，完成基因編輯。

1.3.1.1 gRNA質(zhì)粒構(gòu)建與目的DNA片段的獲得

設(shè)計(jì)兩條反向互補(bǔ)的單鏈DNA，退火后形成雙鏈DNA，該雙鏈兩端由pGRB的同源序列組成，中間部分為靶位點(diǎn)的特定gRNA序列。雙鏈DNA與線性化pGRB在同源重組酶作用下形成gRNA表達(dá)質(zhì)粒。

使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，以待編輯基因上下游序列為模板，設(shè)計(jì)上下游同源臂的引物；以待整合基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)整合基因的擴(kuò)增引物。通過聚合成酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法擴(kuò)增待編輯基因的上下游同源臂和整合基因片段，后經(jīng)重疊PCR制備重組片段。

1.3.1.2 重組菌株構(gòu)建

將pREDCas9質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌W3110感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并接種至LB培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)10～12 h后，接1～1.5 mL菌液轉(zhuǎn)至100 mL 2×YT培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌OD600nm達(dá)0.1～0.2時(shí)，添加0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.4～0.6左右收集菌體，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)。將gRNA質(zhì)粒和重組DNA片段加入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，于1 mL復(fù)蘇液中32 ℃復(fù)蘇2 h。然后取100 μL菌液涂布至含奇霉素和氨芐青霉素抗性的LB平板，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將篩選得到的正確陽性重組菌接至含0.2%阿拉伯糖和奇霉素抗性的LB培養(yǎng)基，誘導(dǎo)pREDCas9中的質(zhì)粒消除系統(tǒng)切割pGRB質(zhì)粒，最后將僅含pREDCas9質(zhì)粒的菌株于42 ℃培養(yǎng)10～12 h，消除溫敏性質(zhì)粒pREDCas9，獲得無質(zhì)粒菌株。

1.3.2 L-Phe發(fā)酵

1.3.2.1 搖瓶發(fā)酵

將菌株接種至18 mm×180 mm的試管斜面培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)2 代，每代12 h，后將二代斜面中的菌株接種至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h。然后按10%～15%接種量轉(zhuǎn)接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為8 mg/L的苯酚紅作為酸堿指示劑，培養(yǎng)過程中需根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化手動(dòng)補(bǔ)加氨水以維持培養(yǎng)基pH 7.0左右，當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)，培養(yǎng)基顏色呈紅色且不變色，通過移液槍一次性補(bǔ)加1 mL的60 g/100 mL葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行。

1.3.2.2 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

菌株活化后，用無菌水將茄形瓶中的菌落沖洗下來制成菌懸液，全部接種到裝有3 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵過程中控制pH 7.0左右，溫度恒定在37 ℃，溶氧保持在25%～35%之間，至種子OD600nm達(dá)到10～16時(shí)，按15%的接種量接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中維持pH 7.0左右，溫度保持在37 ℃，溶氧控制在25%～35%之間。當(dāng)罐中的葡萄糖耗盡時(shí)，開始以一定速率流加質(zhì)量濃度80 g/100 mL的葡萄糖溶液，維持罐中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～5 g/L內(nèi)。

1.3.2.3 發(fā)酵過程中檢測與分析

發(fā)酵過程中菌體生物量通過紫外分光光度儀檢測OD600nm。發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度通過SBA生物傳感儀檢測。發(fā)酵液L-Phe含量通過高效液相色譜儀檢測，色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為10%乙腈溶液，柱溫40 ℃，檢測波長210 nm，流動(dòng)相總流速1 mL/min，采用二元梯度洗脫的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Phe合成支路強(qiáng)化

按系統(tǒng)代謝工程思路對(duì)L-Phe合成途徑進(jìn)行模塊化改造，首先對(duì)合成途徑的后半段進(jìn)行改造，即L-Phe合成途徑中分支酸到L-Phe的反應(yīng)。這一過程由分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶PheA和轉(zhuǎn)氨酶TyrB共同參與完成，是L-Phe合成途徑中的主要限速步驟之一。其中PheA受到L-Phe強(qiáng)烈的反饋抑制。此外，與L-Phe合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶的表達(dá)還受到抑制因子TyrR的抑制[12-13]。根據(jù)報(bào)道，可通過保留PheA酶的分支酸變位酶區(qū)（1～109位氨基酸）和預(yù)苯酸脫水酶區(qū)（110～285位氨基酸）解除L-Phe的反饋抑制[14-15]。

圖2 過表達(dá)雙功能酶PheA及轉(zhuǎn)氨酶TyrB對(duì)L-Phe產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of overexpression of bifunctional enzyme PheA and transaminase TyrB on L-Phe production

對(duì)此，首先以本實(shí)驗(yàn)室的大腸桿菌W3110為出發(fā)菌株，通過敲除該菌株乳糖操縱子中的lacI基因，獲得菌株P(guān)HE1，以解除LacI阻遏蛋白對(duì)啟動(dòng)子Ptrc的阻遏調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建解除反饋抑制的pheA*片段，然后在tyrR位點(diǎn)將pheA*與tyrB串聯(lián)成操縱子，由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建菌株P(guān)HE2。搖瓶發(fā)酵測試后，檢測到L-Phe有積累。為驗(yàn)證其最適表達(dá)量，又在假基因gapC及yeeP位點(diǎn)分別整合了這2 種酶的雙拷貝及三拷貝，均由Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，分別構(gòu)建了PHE3-1和PHE3-2。搖瓶結(jié)果如圖2所示，PHE2的L-Phe產(chǎn)量為6.5 g/L，PHE3-1的L-Phe產(chǎn)量達(dá)8.8 g/L，較PHE2提高了36.22%。而PHE3-2的產(chǎn)量又下降至6.5 g/L，說明關(guān)鍵酶的表達(dá)不宜過強(qiáng)，由Ptrc啟動(dòng)子控制的關(guān)鍵酶PheA及TyrB雙拷貝效果最好。

2.2 莽草酸合成途徑優(yōu)化

表1 莽草酸途徑基因的改造對(duì)L-Phe生產(chǎn)的影響Table 1 Effects of modification of genes in the shikimate pathway on L-Phe production

莽草酸途徑連接中心代謝途徑和分支酸途徑，是L-Phe合成途徑的重要組成部分[16]。作為連接中心代謝途徑與分支途徑的中間通路，莽草酸途徑的通暢對(duì)于平衡代謝通量分布，減少毒副產(chǎn)物（如莽草酸等）積累至關(guān)重要[17-18]。本研究通過對(duì)莽草酸途徑中各反應(yīng)酶的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行梯度優(yōu)化，測試莽草酸途徑中各基因的改造對(duì)L-Phe合成及菌體生長的影響。在PHE3-1的基礎(chǔ)上，依次替換莽草酸途徑各酶的啟動(dòng)子，從莽草酸途徑后段向前逐步確定各酶最適活力，構(gòu)建了表1菌株。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表1所示，其中PHE5-2（過表達(dá)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA）產(chǎn)量為9.3 g/L，較PHE3-1（8.4 g/L）提高了10.56%；在此基礎(chǔ)上，依次對(duì)其余酶的表達(dá)量進(jìn)行了優(yōu)化，最終僅有PHE8-2（過表達(dá)3-脫氫奎寧脫水酶AroD）對(duì)產(chǎn)物合成產(chǎn)生了正向作用。PHE8-2的L-Phe產(chǎn)量達(dá)11.9 g/L，與PHE5-2相比提高了27.96%。推測改造后的正向菌株應(yīng)對(duì)產(chǎn)量或生長有積極的影響。經(jīng)過多輪優(yōu)化篩選，最終確定在6 種酶中，僅有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA和3-脫氫奎寧脫水酶AroD可以通過適度強(qiáng)化提高L-Phe產(chǎn)量且不影響菌體生長，其余酶的表達(dá)水平已達(dá)最佳，無需優(yōu)化。

莽草酸途徑中，PEP和E4P在DAHP合成酶作用下縮合生成DAHP是L-Phe合成途徑的另一限速步驟[19]。DAHP合成酶由3 種同工酶AroF、AroG、AroH組成，其中AroG占大部分酶活力，受到L-Phe的反饋抑制[20-21]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將編碼AroG蛋白的第180位絲氨酸突變?yōu)長-Phe可解除L-Phe的反饋抑制作用[22-23]。本研究以PHE8-2為出發(fā)菌，分別整合了由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc控制的aroG*基因及其雙拷貝，構(gòu)建了菌株P(guān)HE10及PHE11。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，PHE10與PHE11的L-Phe產(chǎn)量分別為16.8 g/L與16.6 g/L，其中PHE10較PHE8-2（11.23 g/L）提高了49.77%，說明適度強(qiáng)化DAHP合成酶可顯著提高L-Phe產(chǎn)量。

圖3 增強(qiáng)DAHP合成酶表達(dá)對(duì)L-Phe合成的影響Fig. 3 Effects of enhanced expression of DAHP synthase on L-Phe synthesis

2.3 前體物供應(yīng)增加

PEP作為合成芳香族氨基酸的前體物之一，同時(shí)還被多條代謝途徑競爭，分流十分明顯，僅有少部分PEP能夠流向莽草酸途徑，因此PEP的供應(yīng)也是合成L-Phe的限制性因素之一[14]。中心代謝途徑中一部分PEP會(huì)在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，隨后進(jìn)入三羧酸循環(huán)[24]。因此，為在增加PEP供應(yīng)的同時(shí)減少對(duì)菌體生長的影響，僅敲除丙酮酸激酶（pykF與pykA編碼）中的pykF基因，構(gòu)建了菌株P(guān)HE12。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，PHE12產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L，比出發(fā)菌PHE10（16.94 g/L）提高了21.13%。說明敲除丙酮酸激酶可有效增加PEP供應(yīng)，進(jìn)而提升L-Phe產(chǎn)量。

圖4 敲除丙酮酸激酶pykF對(duì)L-Phe合成的影響Fig. 4 Effect of pykF knockout on L-Phe synthesis

此外，中心代謝途徑中丙酮酸也會(huì)在磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps的作用下反向生成PEP[25]。因此，本研究嘗試在PHE12基礎(chǔ)上用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子對(duì)pps基因進(jìn)行強(qiáng)化，分別構(gòu)建PHE13-1、PHE13-2和PHE13-3（分別由PBBa_j23106、Ptrp和Ptrc進(jìn)行調(diào)控）。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，與ΔpykF不同，增強(qiáng)pps基因表達(dá)后，L-Phe產(chǎn)量呈不同程度的降低，而生長并未受到明顯影響。由于PykF在丙酮酸激酶中占主要酶活力，在ΔpykF后，PEP生成丙酮酸的代謝流被減弱，胞內(nèi)丙酮酸含量減少。而相應(yīng)地，為保證生長不受影響，菌體通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制強(qiáng)化了PEP到草酰乙酸的合成[26]。此時(shí)過表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps也再難產(chǎn)生更多PEP，限制了L-Phe產(chǎn)量。此外，胞內(nèi)E4P供應(yīng)不足時(shí)，也無法與PEP縮合生成DAHP，使反應(yīng)向下進(jìn)行。為了驗(yàn)證本研究推測，隨后對(duì)轉(zhuǎn)酮酶TktA進(jìn)行了強(qiáng)化。

圖5 增強(qiáng)磷酸烯醇丙酮酸合成酶表達(dá)對(duì)L-Phe合成的影響Fig. 5 Effects of enhanced expression of phosphoenolpyruvate synthase on L-Phe synthesis

與PEP不同，E4P在代謝網(wǎng)絡(luò)中分流并不明顯，可通過過表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶基因tktA增加E4P的供應(yīng)[27-28]。為驗(yàn)證上述猜想，在PHE13-3的基礎(chǔ)上嘗試?yán)貌煌瑥?qiáng)度啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)酮酶基因tktA，分別構(gòu)建了PHE14-1和PHE14-2（分別由PtktA和PBBa_j23106進(jìn)行調(diào)控）。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，增強(qiáng)E4P供應(yīng)后，產(chǎn)量仍呈下降趨勢，可以判斷此前的E4P供應(yīng)充足，不需要加強(qiáng)，且在ΔpykF后，通過強(qiáng)化磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps再難增加PEP供應(yīng)。此外，在本課題組之前研究中，也嘗試過敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，以及利用其他酶代替PTS系統(tǒng)進(jìn)行糖的攝取以增加PEP供應(yīng)，而這些策略在增加PEP的同時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響菌體的生長。因此僅保留ΔpykF菌株（PHE12）作為最終改造的無質(zhì)粒、非缺陷型L-Phe工程菌株，并進(jìn)行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵測試。

圖6 增強(qiáng)轉(zhuǎn)酮酶TktA的表達(dá)對(duì)L-Phe合成的影響Fig. 6 Effect of enhanced expression of transketolase TktA on L-Phe synthesis

2.4 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測試結(jié)果

為測試效果最佳的PHE12的綜合生產(chǎn)性能，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵過程無需添加抗生素及缺陷型氨基酸，降低了發(fā)酵生產(chǎn)成本）。如圖7所示，發(fā)酵初期菌體生長迅速，于36 h OD600nm值達(dá)到最高，隨后逐漸降低。發(fā)酵12 h后，L-Phe產(chǎn)量呈穩(wěn)定趨勢一直增長。生產(chǎn)至48 h后，L-Phe產(chǎn)量達(dá)81.8 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)1.7 g/（L·h），糖酸轉(zhuǎn)化率（以葡萄糖計(jì)）為0.24 g/g。

圖7 工程菌PHE12在5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵曲線Fig. 7 Time course of fed-batch fermentation of the engineered strain PHE12 in a 5 L bioreactor

3 結(jié) 論

本研究按照系統(tǒng)代謝工程思路對(duì)L-Phe代謝途徑進(jìn)行模塊化改造，構(gòu)建了1 株非缺陷型、無質(zhì)粒、高效合成L-Phe的大腸桿菌工程菌株。該菌株構(gòu)建過程如下：1）通過在轉(zhuǎn)錄抑制因子TyrR位點(diǎn)處整合解除反饋抑制的雙功能酶與轉(zhuǎn)氨酶，增強(qiáng)了L-Phe的合成；2）通過對(duì)莽草酸途徑各基因進(jìn)行梯度強(qiáng)度優(yōu)化，確定了各反應(yīng)中酶的最適表達(dá)強(qiáng)度，同時(shí)確保了后半段代謝通路的通暢；3）通過引入解除反饋抑制的DAHP合成酶增強(qiáng)L-Phe的合成途徑；4）通過敲除丙酮酸激酶PykF增加PEP的供應(yīng)，進(jìn)而增加L-Phe產(chǎn)量，以葡萄糖為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵48 h，工程菌PHE12的L-Phe產(chǎn)量達(dá)到81.8 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)0.24 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)1.7 g/（L·h）。目前文獻(xiàn)報(bào)道的L-Phe最高發(fā)酵水平為72.9 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.4 g/（L·h）（發(fā)酵52 h），與該菌株相比，PHE-12的L-Phe產(chǎn)量提高了12.2%，生產(chǎn)強(qiáng)度較該菌株提高21.4%。與現(xiàn)有L-Phe工程菌株相比，該工程菌具備以下優(yōu)點(diǎn)：1）菌株為非缺陷型且不含質(zhì)粒，避免了抗生素及缺陷型氨基酸的使用；2）生產(chǎn)強(qiáng)度高。該工程菌的構(gòu)建降低了生產(chǎn)成本，具有良好的工業(yè)化前景。