林曉彤，董良波，鄭俊威，王 斌,2，潘 力,2,*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

氨肽酶是一種外肽酶，它依次水解多肽鏈N端上的氨基酸，并一次釋放1～2 個(gè)氨基酸。大多數(shù)氨肽酶是金屬蛋白酶，需要1 個(gè)或2 個(gè)二價(jià)金屬離子作為活性中心[1-2]。亮氨酸氨肽酶（EC 3.4.11.1）主要水解以疏水性氨基酸為N端殘基的多肽，水解亮氨酸時(shí)活性最高[3]。在食品工業(yè)中，許多食品蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生苦味物質(zhì)，從而限制了蛋白質(zhì)水解物的應(yīng)用，而亮氨酸氨肽酶可以選擇性地從多肽鏈或蛋白上切除末端的疏水性氨基酸殘基，對(duì)蛋白水解液具有很好的脫苦作用[4-5]。

目前報(bào)道的氨肽酶來(lái)源廣泛，存在于動(dòng)植物組織和各種微生物中，如Aspergillus oryzae、A. sojae、Bacillus subtilis和Pseudomonas等[6-7]。亮氨酸氨肽酶IV從豬腸黏膜中分離出來(lái)，Mg2+和Mn2+對(duì)該酶有一定的激活作用[8]。Nakadai等[9-12]首先從米曲霉中提取并純化了1 個(gè)羧基肽酶和3 個(gè)亮氨酸氨基肽酶。Blinkovsky等[13]從米曲霉中克隆表達(dá)了亮氨酸氨肽酶2，發(fā)現(xiàn)其特異性廣，可水解多種氨基酸殘基。近年來(lái)，在畢赤酵母中表達(dá)了A. sojae來(lái)源的lap1基因，其亮氨酸氨肽酶活力（766.9 U/mL）是真菌表達(dá)系統(tǒng)中的較高水平[14]，但總體來(lái)說(shuō)，食品級(jí)安全的亮氨酸氨肽酶表達(dá)水平不高[15]，在較大程度上限制了其工業(yè)應(yīng)用。

黑曲霉（A. niger）具有旺盛的蛋白表達(dá)分泌能力以及強(qiáng)大的繁殖能力，其普遍應(yīng)用于工業(yè)重組蛋白、檸檬酸等的生產(chǎn)[16-17]，被廣泛地用于重組蛋白的表達(dá)[18-20]。黑曲霉被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為GRAS（Generally Regarded as Safe）范圍的安全菌種[21]，作為食品行業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株。本研究利用低蛋白背景的無(wú)孢黑曲霉HL-1作為宿主，使用黑曲霉自身雜合啟動(dòng)子（PnaII）篩選曲霉中高酶活力的亮氨酸氨肽酶基因，再結(jié)合規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9工具提高基因整合效率，實(shí)現(xiàn)亮氨酸氨肽酶基因lapA的過(guò)量表達(dá)。通過(guò)融合6×His標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)重組亮氨酸氨肽酶LapA的純化，研究重組亮氨酸氨肽酶LapA的酶學(xué)性質(zhì)，目前在亮氨酸氨肽酶的表達(dá)研究中，曲霉表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量普遍較低，本實(shí)驗(yàn)旨在提高亮氨酸氨肽酶產(chǎn)量的同時(shí)，為食品級(jí)安全亮氨酸氨肽酶的工業(yè)發(fā)酵表達(dá)量的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Match1 T1感受態(tài) 美國(guó)Invitrogen公司；黑曲霉宿主菌株HL-1（ΔpyrG）由本實(shí)驗(yàn)室改造并保存；通用表達(dá)載體pRpT均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；質(zhì)粒Cas9-hygB由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶（如ApaI）、DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；L-亮氨酸-4-硝基苯胺 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物；CD培養(yǎng)基：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1%KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，2%瓊脂粉，pH 5.5；DPY培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O；發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉，3%玉米漿，2%豆粕粉。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器、高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；AKATA層析儀 美國(guó)通用電氣公司；浸入式水平電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

在uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)上篩選得到米曲霉、醬油曲霉、黑曲霉的亮氨酸氨肽酶基因序列（表1），在SignalP 4.0 server上預(yù)測(cè)其原有的信號(hào)肽，并通過(guò)設(shè)計(jì)引物將其信號(hào)肽替換成糖化酶GlaA信號(hào)肽，并在反向引物上加入6×His-Tag的標(biāo)簽序列。以各曲霉的基因組為模板，使用特異性引物（表2）擴(kuò)增得到目的基因，引物對(duì)PnaII-F和PnaII-R擴(kuò)增雜合啟動(dòng)子PnaII（由淀粉酶AmyB啟動(dòng)子和TPI的5’UTR組成）。

表1 本研究所擴(kuò)增的基因Table 1 Genes used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Sequences of PCR primers used in this study

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以米曲霉、醬油曲霉和黑曲霉的基因組為模板，分別使用對(duì)應(yīng)的特異性引物（如lapA-F和lapA-R）擴(kuò)增得到目的基因（如lapA），將目的基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S或lap1N）、啟動(dòng)子和pRpT線性化載體（含有篩選標(biāo)記pyrG、終止子Ttef和同源臂amyA-HR）通過(guò)同源片段在DNA連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)amp抗性篩選，通過(guò)菌液電泳驗(yàn)證質(zhì)粒大小是否正確，得到不同目的基因的雜合啟動(dòng)子重組表達(dá)載體。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，將構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體命名為pMD20-PnaII-Target gene，使用ApaI單酶切線性化。

1.3.3 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

首先采用酶解法制備黑曲霉宿主HL-1的原生質(zhì)體[22]，將線性化的表達(dá)載體pMD20-PnaII-Target gene與原生質(zhì)體相混合，利用CaCl2-聚乙二醇法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化[23]，涂布于高滲CD平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)后兩組轉(zhuǎn)化子基因組用PnaIIp-F和Ttefp-R引物經(jīng)過(guò)PCR鑒定，檢測(cè)目的基因是否整合入黑曲霉宿主基因組中，得到重組菌株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 重組表達(dá)菌株的搖瓶發(fā)酵及酶活力檢測(cè)

將重組菌株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于液體淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)，按24 h間隔分別取樣，8 000×g離心5 min，收集上清液。發(fā)酵液稀釋至合適的倍數(shù)，以L-亮氨酸-4-硝基苯胺為底物測(cè)酶活力[9,15,24]，檢測(cè)反應(yīng)體系在405 nm波長(zhǎng)處的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為：在65 ℃和pH 8.5條件下，每分鐘水解底物亮氨酸對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μg對(duì)硝基苯胺所消耗的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 重組亮氨酸氨肽酶LapA的純化

由于LapA帶有6×His標(biāo)簽，故采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，重組菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)7 d后，收集上清液用于純化。使用的層析柱為HisTrapTMHP，上樣量為30 mL，采用梯度洗脫法（咪唑濃度0～0.5 mol/L），流速2.0 mL/min[25]。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)純化效果，再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.6 重組亮氨酸氨肽酶LapA酶學(xué)特性分析

最適溫度和pH值的測(cè)定：在pH 8條件下，設(shè)置不同溫度梯度15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃，測(cè)定酶活力隨溫度的變化；在測(cè)得的最適反應(yīng)溫度條件下，測(cè)定不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0）條件下的酶活力，以最適條件下所得的酶活力為100%。

熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測(cè)定：酶液在不同溫度（55～75 ℃）保溫2 h，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定剩余酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%；將酶液置于不同pH值（6.0～10.0）緩沖液中，65 ℃保溫2 h后在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定剩余酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

金屬離子及表面活性劑SDS對(duì)氨肽酶活力的影響：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定體系中分別加入不同金屬離子及表面活性劑SDS，使其終濃度為5 mmol/L，測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.7 利用CRISPR/Cas9工具提高LapA蛋白的表達(dá)量

傳統(tǒng)的同源重組轉(zhuǎn)化是利用CaCl2-聚乙二醇法誘導(dǎo)，將線性化的表達(dá)載體pMD20-PnaII-Target gene與原生質(zhì)體相混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合CRISPR/Cas9工具，質(zhì)粒Cas9-hygB[26]（帶有Cas9蛋白表達(dá)框和sgRNA表達(dá)框，靶點(diǎn)位于amyA基因內(nèi)）和線性化的表達(dá)載體pMD20-PnaII-Target gene共轉(zhuǎn)[27]，培養(yǎng)后兩組轉(zhuǎn)化子用PnaIIp-F和Ttefp-R引物經(jīng)過(guò)PCR鑒定，檢測(cè)目的基因是否整合入黑曲霉宿主基因組中，得到兩組不同方法的重組菌株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并測(cè)定表達(dá)菌株目的基因拷貝數(shù)。

1.3.8 real-time PCR體系和反應(yīng)條件

real-time PCR體系如表3所示。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性5 s；60 ℃退火34 s）。

表3 real-time PCR擴(kuò)增體系Table 3 Formulation of real-time PCR amplification system

1.3.9 表達(dá)菌株目的基因拷貝數(shù)的測(cè)定

選用gpda為內(nèi)源參照基因[28]，對(duì)酶活力最高基因進(jìn)行real-time PCR分析，構(gòu)建包含目的基因和內(nèi)源參照基因gpda單拷貝標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使用Nano Drop1000測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度和質(zhì)量，計(jì)算相應(yīng)拷貝數(shù)，并用無(wú)菌RNase free水將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)分別稀釋到相應(yīng)梯度。用初始質(zhì)量濃度10 ng/μL重組轉(zhuǎn)化子基因組作為模板稀釋到相應(yīng)梯度，分別以qGPDA-F、qGPDA-R和qLapA-F、qLapA-R為引物擴(kuò)增目的基因（146 bp）和gpda的部分片段（157 bp），根據(jù)其Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到內(nèi)參基因和目的基因的初始拷貝數(shù)，目的基因拷貝數(shù)是目的基因和內(nèi)參基因初始拷貝數(shù)的比值[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高表達(dá)亮氨酸氨肽酶基因篩選

為篩選高表達(dá)的亮氨酸氨肽酶基因，從米曲霉、黑曲霉和醬油曲霉中篩選出5 個(gè)亮氨酸氨肽酶，利用MEGA7進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖1A），根據(jù)亮氨酸氨肽酶基因氨基酸序列的進(jìn)化樹顯示，大概分為3 個(gè)分支，lap1N與lap1O關(guān)系較近，置信度可達(dá)到100；lapA與lap1S關(guān)系較近，置信度可達(dá)到100；lap2單獨(dú)為一個(gè)分支。SignalP 4.0服務(wù)器預(yù)測(cè)的5 個(gè)亮氨酸氨肽酶基因都含有N端信號(hào)肽，用黑曲霉的glaA信號(hào)肽所取代。

圖1 從曲霉中篩選高表達(dá)的亮氨酸氨基肽酶基因Fig. 1 Screening of highly expressed leucine aminopeptidase genes from Aspergillus

為了篩選高表達(dá)亮氨酸氨基肽酶的轉(zhuǎn)化子，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。96 h取發(fā)酵液，測(cè)定酶活力。從圖1C可以看出，LapA亮氨酸氨肽酶活性最高（2 212.3 U/mL），遠(yuǎn)高于Lap1S亮氨酸氨肽酶活性（231.8 U/mL）和Lap2亮氨酸氨肽酶活性（41.5 U/mL）。然而，Lap1N和Lap1O幾乎沒有顯示出任何亮氨酸氨肽酶活性。

LapA蛋白分子質(zhì)量約為35.0 kDa，小于預(yù)測(cè)分子質(zhì)量41.1 kDa（圖1D泳道1），是由于成熟的LapA是通過(guò)從LapA前體蛋白中去除前79 個(gè)N端氨基酸而形成的[15]，導(dǎo)致了LapA的實(shí)際分子質(zhì)量小于預(yù)測(cè)分子質(zhì)量。Lap2蛋白分子質(zhì)量約為66.2 kDa，大于預(yù)測(cè)分子質(zhì)量53.6 kDa（圖1D泳道2），可能是由于蛋白的糖基化使分子質(zhì)量增大。Lap1S的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為41.2 kDa，可能被中性淀粉酶AmyA（45 kDa）覆蓋（圖1D泳道3）。

2.2 利用CRISPR/Cas9工具高水平表達(dá)重組亮氨酸氨肽酶

為了進(jìn)一步提高LapA的表達(dá)水平，使用CRISPR/Cas9工具進(jìn)行轉(zhuǎn)化作為表達(dá)策略。結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9工具表達(dá)的轉(zhuǎn)化子（LapA-C）蛋白帶較常規(guī)同源重組表達(dá)的轉(zhuǎn)化子（LapA-T）蛋白帶更粗（圖2A、B）。兩種表達(dá)方法的氨肽酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，LapA-T在72 h達(dá)到最高值，LapA-C在120 h達(dá)到最高值。LapA-T的氨基肽酶活力最高為2 476.0 U/mL（圖2C），而LapA-C的酶活力最高為11 701.2 U/mL（圖2D），約為L(zhǎng)apA-T的4.7 倍。real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8（lapA）和0.999 9（gpda），結(jié)果可靠，LapA-C的基因拷貝數(shù)是LapA-T的2.1 倍（圖2E、F），提高了基因插入的拷貝數(shù)。

圖2 傳統(tǒng)同源轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化子（LapA-T）和運(yùn)用CRISPR/Cas9工具轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子（LapA-C）對(duì)lapA基因表達(dá)量的比較Fig. 2 Comparison of expression levels of genes in conventional homologous transformants (LapA-T) and transformants obtained using CRISPR/Cas9 (LapA-C)

2.3 重組亮氨酸氨肽酶LapA的純化

將LapA-C轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清液經(jīng)過(guò)親和層析，蛋白純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，如圖3所示，條帶1為發(fā)酵液原液，條帶2為純化后的亮氨酸氨肽酶樣品，LapA蛋白分子質(zhì)量約為35.0 kDa。

圖3 重組亮氨酸氨肽酶LapA的純化Fig. 3 SDS-PAGE profile of purified LapA

2.4 重組亮氨酸氨肽酶LapA酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)純化后重組亮氨酸氨肽酶LapA活力的影響重組LapA在65 ℃時(shí)酶活力最高（圖4A），而且在55～60 ℃時(shí)酶活力較穩(wěn)定，可以保持50%以上的相對(duì)酶活力（圖4B）。

圖4 溫度對(duì)純化后重組LapA活力的影響Fig. 4 Effects of temperature on the activity of the purified recombinant LapA

2.4.2 pH值對(duì)純化后重組LapA活力的影響

重組LapA在pH 8.5時(shí)酶活力最高（圖5A），在酸性條件下基本沒有活性，當(dāng)pH值大于10，酶活力基本為0，而且在7.5～8.5時(shí)LapA酶活力較穩(wěn)定，可以保持50%以上的相對(duì)酶活力（圖5B）。

圖5 pH值對(duì)純化后重組LapA活力的影響Fig. 5 Effects of pH on the activity of the purified recombinant LapA

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組LapA的影響

表4 金屬離子及表面活性劑對(duì)重組LapA活力的影響Fig. 4 Effect of metal ions and surfactants on the activity of LapA

表4表明，在5 mmol/L濃度下，K+對(duì)該重組酶具有激活作用，而Ba2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+有明顯的抑制作用，其中Ni2+、Ca2+抑制作用較為明顯，而表面活性劑SDS對(duì)重組酶有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

黑曲霉作為重組蛋白表達(dá)的重要宿主，具有蛋白分泌量大、可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾及高生物安全性等優(yōu)點(diǎn)[30]。本研究為實(shí)現(xiàn)異源蛋白在黑曲霉中的高效表達(dá)，通過(guò)將信號(hào)肽替換為高分泌的糖化酶的信號(hào)肽，使用強(qiáng)啟動(dòng)子（雜合啟動(dòng)子PnaII），增加基因拷貝數(shù)的表達(dá)策略，篩選曲霉得到高酶活力的亮氨酸氨肽酶基因，并以雜合啟動(dòng)子PnaII、Ttef終止子作為表達(dá)載體元件，pyrG為雙向篩選標(biāo)記，構(gòu)建亮氨酸氨肽酶重組表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)同源重組和CRISPR/Cas9工具轉(zhuǎn)化黑曲霉HL-1，提高目的基因的基因重組效率，使亮氨酸氨肽酶基因lapA的拷貝數(shù)增加，以此提高蛋白的表達(dá)量。通過(guò)PCR鑒定和測(cè)定發(fā)酵液的酶活力，篩選出成功轉(zhuǎn)化的重組亮氨酸氨肽酶菌株LapA-C，達(dá)到11 701.2 U/mL，而對(duì)照組（不使用CRISPR/Cas9工具）的重組亮氨酸氨肽酶菌株LapA-T發(fā)酵液酶活力為2 476.0 U/mL，均顯著高于先前的報(bào)道[15,24]。再經(jīng)過(guò)親和層析對(duì)重組亮氨酸氨肽酶LapA進(jìn)行親和層析純化，SDS-PAGE鑒定顯示LapA蛋白分子質(zhì)量在35.0 kDa左右。同時(shí)驗(yàn)證了溫度、pH值對(duì)重組亮氨酸氨肽酶LapA活力的影響，亮氨酸氨肽酶LapA在pH 8.5時(shí)酶活力最高，而且在pH 7.5～8.5時(shí)酶活力較穩(wěn)定；亮氨酸氨肽酶LapA在溫度65 ℃時(shí)酶活力最高，55～60 ℃時(shí)酶活力較穩(wěn)定，5 mmol/L的K+對(duì)該重組酶具有激活作用。本研究的成果為食品級(jí)安全亮氨酸氨肽酶LapA的工業(yè)發(fā)酵表達(dá)量的提高提供了理論依據(jù)。后續(xù)可以進(jìn)一步研究黑曲霉宿主的改造以及亮氨酸氨肽酶LapA的定點(diǎn)突變研究，以得到酶活力更高的黑曲霉菌株和酶學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定的亮氨酸氨肽酶。