賈園園，李 祥，張振華，張 閃，楊露露，唐存多,2,*

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061；

2.車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061）

L-苯甘氨酸是一種高值的非天然芳香族α-氨基酸，是合成食品添加劑和藥物中間體重要的手性砌塊[1-2]。L-苯甘氨酸及其衍生物是合成紫杉醇[3]、β-內(nèi)酰胺類抗生素[4]及重磅炸彈藥物——氯吡格雷的重要中間體[5]。隨著化工技術(shù)的不斷發(fā)展，L-苯甘氨酸的化學(xué)合成工藝已非常成熟。但其傳統(tǒng)的合成過(guò)程所使用的氰化物或強(qiáng)堿，對(duì)工人的安全威脅較大，且對(duì)環(huán)境極不友好[5]。此外，化學(xué)合成L-苯甘氨酸的對(duì)映選擇性較差，增大了后續(xù)純化精制的成本。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，新型的生物合成具有手性選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好及對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)勢(shì)[6]，隨著環(huán)境問(wèn)題日益突出，綠色、環(huán)保的生物合成更受關(guān)注和青睞[7-10]。近年來(lái)，關(guān)于苯甘氨酸生物合成研究較多的主要有苯海因酶轉(zhuǎn)化法[11]、D-苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶法[12]和氨基酸脫氫酶法[13]等。然而，它們?nèi)源嬖谝欢ǖ娜毕?，例如需要硫酸輔助[11]、催化活性低[12]或需要額外的輔酶循環(huán)系統(tǒng)[13]等。因此，開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)化率高、對(duì)映選擇性好、成本低廉且環(huán)境友好的L-苯甘氨酸生物合成工藝具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用前景[14]。

扁桃酸消旋酶（mandelate racemase，MR）能夠催化扁桃酸消旋反應(yīng)[15-17]，D-扁桃酸脫氫酶（D-mandelate dehydrogenase，DMDH）能選擇性地催化D-扁桃酸脫氫氧化[18-19]，而L-亮氨酸脫氫酶（L-leucine dehydrogenase，L-LeuDH）能催化苯乙酮酸的胺化還原[20-21]，它們?cè)贚-苯甘氨酸生物合成中有巨大的應(yīng)用潛力。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)成功以DMDH和L-LeuDH為核心催化劑，構(gòu)建了能夠?qū)崿F(xiàn)輔酶內(nèi)循環(huán)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，基于輔酶內(nèi)循環(huán)，在不引入輔底物及額外催化劑的前提下，實(shí)現(xiàn)了L-苯甘氨酸的高效生物合成。200 mmol/L的D-扁桃酸在合適條件下反應(yīng)12 h，L-苯甘氨酸的得率可達(dá)98%，且對(duì)映體過(guò)量值（enantiomeric excess，e.e.）大于98%[7]。目前，生物催化常用的催化劑主要有酶、細(xì)胞器和微生物細(xì)胞[6]，這3 種催化劑各有優(yōu)勢(shì)。其中，全細(xì)胞催化具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其是在有氧化還原反應(yīng)參與的生物催化過(guò)程中，以微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行催化反應(yīng)可以利用細(xì)胞體內(nèi)的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，不需要額外添加輔酶；同時(shí)，以全細(xì)胞作為生物催化劑能夠提高催化劑的穩(wěn)定性，減少催化劑的用量[22-24]，且便于催化劑使用后的回收利用以及后續(xù)與產(chǎn)物的分離，能降低催化劑的使用成本及后續(xù)的分離成本[25]。迄今為止，全細(xì)胞催化技術(shù)用于工業(yè)化生產(chǎn)的案例也越來(lái)越多[26-28]。

本研究擬參照?qǐng)D1 的合成路線， 考察攜帶Agrobacterium radiobacter來(lái)源MR（ArMR）、Lactobacillus harbinensi來(lái)源DMDH（LhDMDH）和Exiguobacterium sibiricumDSM 17290來(lái)源LeuDH（EsLeuDH）編碼基因的重組大腸桿菌全細(xì)胞，對(duì)D,L-扁桃酸的轉(zhuǎn)化情況，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定，為實(shí)現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)?；纳锖铣傻於▓?jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖1 全細(xì)胞催化生成L-苯甘氨酸的流程圖Fig. 1 Flow chart showing whole-cell catalytic production of L-phenylglycine

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

底物D,L-扁桃酸、L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氘代二甲亞砜 上海麥克林生化科技有限公司；NAD+深圳邦泰生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

Escherichia coliBL21（DE3）、攜帶LhDMDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）/pET28a-LhDMDH[7]和ArMR基因的重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）/pET28a-ArMR菌株[1]由本課題組構(gòu)建和保藏；攜帶EsLeuDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）/pETDuet-1-EsLeuDH[21]由許建和教授饋贈(zèng)。共表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉和5 g/L酵母提取物，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；蛋白電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；EC 2006型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 大連依利特分析儀器有限公司；Hypersil C18柱、LTQ Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) 美國(guó)Thermo Scientific公司；Chirobiotic T手性柱 美國(guó)Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建

分別將質(zhì)粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用割膠回收試劑盒回收酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1，用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。再分別將pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用割膠回收試劑盒回收酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH，用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落PCR檢測(cè)、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后，將pET28a-ArMR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選，獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。

將上述重組菌連續(xù)在無(wú)抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次，然后接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察的生長(zhǎng)情況，通過(guò)雙重抗性篩選考察重組菌攜帶質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性[1]。

1.3.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

授課教師要根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行充分的分析、討論，如果課程達(dá)成度高于要求值，說(shuō)明該課程可以實(shí)現(xiàn)對(duì)指標(biāo)點(diǎn)的支撐，如果課程達(dá)成度低于要求值，教師需要改進(jìn)教學(xué)方法和教學(xué)水平。專業(yè)負(fù)責(zé)人要根據(jù)畢業(yè)要求達(dá)成度進(jìn)行研究，如果個(gè)別指標(biāo)點(diǎn)達(dá)成度低于要求值，需要與相關(guān)教師尤其是勉強(qiáng)支撐課程的教師溝通，幫助教師提高教學(xué)水平，如果總的畢業(yè)要求達(dá)成度低于要求值，需要對(duì)課程體系進(jìn)行修訂。

重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)采用低溫、低誘導(dǎo)劑濃度的誘導(dǎo)策略進(jìn)行。分別將E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1和E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR單菌落接種至4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h，2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)2.5 h，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h；取10 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，重懸后進(jìn)行超聲破碎，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[29]。

1.3.3 酶活性分析

DMDH氧化活性：以D-扁桃酸為底物，以NADH生成量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。MR活性：以L-扁桃酸為底物，根據(jù)文獻(xiàn)[7]用HPLC法測(cè)定D-扁桃酸的生成量，以此計(jì)算酶的消旋活性。L-LeuDH還原活性：以苯乙酮酸為底物、NADH為輔酶，加上合適的HN4+，30 ℃條件下用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)340 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化量[21]。

1.3.4 重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化D,L-扁桃酸合成L-苯甘氨酸

取50 mL上述誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-

ArMR，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體，重懸于10 mL 500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液中（pH 9.5），50 mmol/LD,L-扁桃酸，溫度30 ℃，反應(yīng)48 h后取1 mL轉(zhuǎn)化液于8 800×g離心1 min，取上清液，稀釋100 倍后用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，最后用HPLC法檢測(cè)L-苯甘氨酸含量。

1.3.5L-苯甘氨酸的定性分析

先對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行普通C18柱的HPLC分析，HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80，V/V），流速1 mL/min。然后，利用Chirobiotic T手性柱對(duì)產(chǎn)物及L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，流動(dòng)相為甲醇-水-三氟乙酸（20∶80∶0.1，V/V），流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，以此計(jì)算產(chǎn)物中L-苯甘氨酸的e.e.值。根據(jù)在相同分析條件下，產(chǎn)物在普通Thermo Hypersil C18柱以及Chirobiotic T手性柱中的保留時(shí)間，與L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行初步的定性分析。最后，將底物和產(chǎn)物委托基云（上海）生物技術(shù)有限公司，利用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)一步基于質(zhì)荷比對(duì)其進(jìn)行定性分析。

1.3.6L-苯甘氨酸的定量分析

將L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液，然后分別取20 μL進(jìn)行HPLC分析，獲得各濃度L-苯甘氨酸的峰面積后，進(jìn)行線性擬合獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80，V/V），流速1 mL/min。待檢樣品產(chǎn)物按照同樣的條件進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)測(cè)得的峰面積可以由回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的樣品濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進(jìn)行色階、對(duì)比度調(diào)節(jié)及標(biāo)注等處理，圖片中所用的化學(xué)式采用ChemDraw Ultra 8.0進(jìn)行繪制。簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建

按照1.3.1節(jié)方法將質(zhì)粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1進(jìn)行雙酶切，酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1經(jīng)電泳分離和割膠回收，再用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽(yáng)性重組子。挑取陽(yáng)性重組子用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2A所示，片段長(zhǎng)度約1 400 bp，大小與預(yù)期相符。進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2B所示，能夠釋放出與EsLeuDH長(zhǎng)度一致的目的片段（約1 200 bp）。將經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證的重組子送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明EsLeuDH的序列及在載體上的插入位置與預(yù)期的完全一致，表明成功獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。

圖2 E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組子的菌液PCR檢測(cè)（A）及雙酶切驗(yàn)證（B）Fig. 2 PCR detection and double digestion detection of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH

同樣按照1.3.1節(jié)方法將質(zhì)粒pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH進(jìn)行雙酶切，酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH經(jīng)電泳分離和割膠回收，再用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽(yáng)性重組子。挑取陽(yáng)性重組子用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3A所示，片段長(zhǎng)度約1 300 bp，大小與預(yù)期相符。進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3B所示，能夠釋放出與LhDMDH長(zhǎng)度一致的目的片段（約1 100 bp）。將經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證的重組子送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示LhDMDH的序列及在載體上的插入位置與預(yù)期完全一致，表明成功獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后，將pET28a-ArMR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選，獲得E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。重組菌連續(xù)在無(wú)抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次，接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀況良好，表明該重組菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，攜帶的雙質(zhì)粒在傳代過(guò)程不會(huì)發(fā)生質(zhì)粒不相容的現(xiàn)象。

圖3 E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組子的菌液PCR檢測(cè)（A）及雙酶切驗(yàn)證（B）Fig. 3 PCR detection and double digestion verification of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH

2.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

分別將E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1、E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH和E. coliBL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR菌株按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)后的菌液取10 mL離心收集，經(jīng)重懸和超聲破碎后進(jìn)行SDSPAGE及酶活性分析。如圖4所示，E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR的裂解上清液在38 kDa和40～43 kDa處有明顯的特異性條帶，分別與LhDMDH、EsLeuDH[20]和ArMR的理論分子質(zhì)量一致，表明3 個(gè)目標(biāo)酶均成功實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)換算后，發(fā)酵液中的LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。酶活性測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明，借助雙質(zhì)粒共表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了3 個(gè)目標(biāo)酶有活性形式的共表達(dá)。

圖4 重組大腸菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE profile of the expression products of recombinant E. coli

2.3 L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及底物的HPLC分析

按照1.3.6節(jié)方法，將分析純的L-苯甘氨酸在Thermo Hypersil C18柱上進(jìn)行HPLC分析，在該分析條件下，L-苯甘氨酸的保留時(shí)間約為3.43 min（圖5A），將L-苯甘氨酸不同濃度值對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性擬合，獲得的L-苯甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出L-苯甘氨酸濃度對(duì)應(yīng)的回歸方程為y=0.000 2x-0.011，相關(guān)系數(shù)為0.999 0，結(jié)果表明在該HPLC分析條件及濃度范圍下，L-苯甘氨酸濃度與峰面積呈良好線性相關(guān)，因此，利用此法可以對(duì)L-苯甘氨酸進(jìn)行精確定量分析。同樣條件下對(duì)底物D,L-扁桃酸進(jìn)行HPLC分析，底物的保留時(shí)間約為2.33 min（圖5B），這也說(shuō)明D,L-扁桃酸的極性明顯大于L-苯甘氨酸。同時(shí)，由于受D,L-扁桃酸極性的影響，且它的pH值比L-苯甘氨酸高，在與L-苯甘氨酸同樣的分析條件下不利于其有效分離，因此D,L-扁桃酸的色譜峰始終不能對(duì)稱（呈三角形）。而這一現(xiàn)象對(duì)產(chǎn)物鑒定的影響不大，且在與產(chǎn)物共存時(shí)，D,L-扁桃酸的色譜峰反而能呈現(xiàn)較好的對(duì)稱性。

圖5 L-苯甘氨酸（A）及D,L-扁桃酸（B）在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 5 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D,L-mandelic acid (B) on Thermo Hypersil C18 column

2.4 重組大腸桿菌全細(xì)胞催化D,L-扁桃酸合成L-苯甘氨酸

按照1.3.4節(jié)方法對(duì)D,L-扁桃酸進(jìn)行全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化。在D,L-扁桃酸的初始濃度為50、500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液（pH 9.5）的條件下，180 r/min、30 ℃反應(yīng)48 h后，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離心取樣稀釋100 倍后，按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖6所示。在保留時(shí)間約為3.43 min的位置有明顯特征峰，它與相同分析條件下L-苯甘氨酸的保留時(shí)間一致（圖5A），表明在該反應(yīng)條件下有L-苯甘氨酸的生成，經(jīng)過(guò)計(jì)算其得率約為77.48%，較低的得率及底物濃度有待下一步對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖6 催化產(chǎn)物在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 6 HPLC profile of catalytic products on Thermo Hypersil C18 column

將底物及純化產(chǎn)物送至基云（上海）生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖7、8所示。在圖7中，由質(zhì)荷比可以推出物質(zhì)的分子式可能為C8H8O3Na+[M+Na]+，表明該物質(zhì)是C8H8O3（扁桃酸）結(jié)合了1 個(gè)Na+；在圖8中，由質(zhì)荷比可以推出物質(zhì)的分子式可能為C8H10NO2+[M+H]+，表明該物質(zhì)是C8H9NO2（苯甘氨酸）結(jié)合了一個(gè)H+。

圖7 底物的高分辨質(zhì)譜分析Fig. 7 High-resolution mass spectrum of the substrate

圖8 產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜分析Fig. 8 High-resolution mass spectrum of the product

圖9 L-苯甘氨酸（A）及D-苯甘氨酸（B）在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 9 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D-phenylglycine (B)on Chirobiotic T chiral C18 column

用Chirobiotic T手性柱參照1.3.5節(jié)方法對(duì)L-苯甘氨酸、D-苯甘氨酸及純化產(chǎn)物進(jìn)行手性柱的HPLC分析，L-苯甘氨酸和D-苯甘氨酸的保留時(shí)間分別約為7.40 min和8.91 min（圖9），大部分產(chǎn)物的保留時(shí)間在7.40 min左右（圖10），在8.91 min左右的峰面積較小。結(jié)合普通C18柱HPLC分析及高分辨質(zhì)譜的分析結(jié)果，進(jìn)一步表明該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終產(chǎn)物主要為L(zhǎng)-苯甘氨酸，且其e.e.值大于99%，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有較高的對(duì)映體選擇性。本研究與Liu Qiaoli等[14]設(shè)計(jì)的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達(dá)體系相比較，不需要額外添加甲酸鈉之類的輔底物，另外，外消旋扁桃酸相對(duì)苯乙酮酸來(lái)說(shuō)也更廉價(jià)、更易得，具有更大的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

圖10 純化產(chǎn)物在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 10 HPLC profile of purified product on Chirobiotic T chiral C18 column

3 討 論

隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，利用2 個(gè)或更多酶進(jìn)行多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在手性純的化學(xué)品的合成中更受青睞[30]。通常這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以用全細(xì)胞、細(xì)胞裂解液或游離酶作催化劑。與其他2 個(gè)相比，全細(xì)胞催化具有更多的優(yōu)點(diǎn)，包括催化劑更穩(wěn)定、更易回收利用，在一些氧化還原反應(yīng)中無(wú)需添加輔酶等。因此，共表達(dá)多個(gè)酶的全細(xì)胞催化已被廣泛用于眾多化學(xué)品的生物合成。

本研究成功構(gòu)建了攜帶LhDMDH、EsLeuDH和ArMR編碼基因的重組大腸桿菌，重組菌的遺傳穩(wěn)定性良好。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)酵液中LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。共表達(dá)時(shí)，3 個(gè)酶各自的表達(dá)水平與單獨(dú)表達(dá)時(shí)差別不大，進(jìn)一步表明大腸桿菌具有強(qiáng)大的表達(dá)外源蛋白能力。此外，以誘導(dǎo)后的全細(xì)胞為催化劑、D,L-扁桃酸為底物，實(shí)現(xiàn)了L-苯甘氨酸高對(duì)映選擇性的生物合成，在測(cè)定條件下L-苯甘氨酸的得率可達(dá)77.48%，e.e.值大于99%。與Liu Qiaoli等[14]設(shè)計(jì)的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達(dá)體系相比，不需要額外的添加甲酸鈉之類的輔底物，另外，D,L-扁桃酸相對(duì)苯乙酮酸也更廉價(jià)、更易得，具有更大的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。本研究具有較大的產(chǎn)業(yè)化潛力，為實(shí)現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)?；纳锖铣傻於藞?jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。