賈園園,李 祥,張振華,張 閃,楊露露,唐存多,2,*
(1.南陽師范學(xué)院 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室,河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽 473061;
2.車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽 473061)
L-苯甘氨酸是一種高值的非天然芳香族α-氨基酸,是合成食品添加劑和藥物中間體重要的手性砌塊[1-2]。L-苯甘氨酸及其衍生物是合成紫杉醇[3]、β-內(nèi)酰胺類抗生素[4]及重磅炸彈藥物——氯吡格雷的重要中間體[5]。隨著化工技術(shù)的不斷發(fā)展,L-苯甘氨酸的化學(xué)合成工藝已非常成熟。但其傳統(tǒng)的合成過程所使用的氰化物或強(qiáng)堿,對(duì)工人的安全威脅較大,且對(duì)環(huán)境極不友好[5]。此外,化學(xué)合成L-苯甘氨酸的對(duì)映選擇性較差,增大了后續(xù)純化精制的成本。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比,新型的生物合成具有手性選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好及對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)勢(shì)[6],隨著環(huán)境問題日益突出,綠色、環(huán)保的生物合成更受關(guān)注和青睞[7-10]。近年來,關(guān)于苯甘氨酸生物合成研究較多的主要有苯海因酶轉(zhuǎn)化法[11]、D-苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶法[12]和氨基酸脫氫酶法[13]等。然而,它們?nèi)源嬖谝欢ǖ娜毕?,例如需要硫酸輔助[11]、催化活性低[12]或需要額外的輔酶循環(huán)系統(tǒng)[13]等。因此,開發(fā)轉(zhuǎn)化率高、對(duì)映選擇性好、成本低廉且環(huán)境友好的L-苯甘氨酸生物合成工藝具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用前景[14]。
扁桃酸消旋酶(mandelate racemase,MR)能夠催化扁桃酸消旋反應(yīng)[15-17],D-扁桃酸脫氫酶(D-mandelate dehydrogenase,DMDH)能選擇性地催化D-扁桃酸脫氫氧化[18-19],而L-亮氨酸脫氫酶(L-leucine dehydrogenase,L-LeuDH)能催化苯乙酮酸的胺化還原[20-21],它們?cè)贚-苯甘氨酸生物合成中有巨大的應(yīng)用潛力。在前期研究中,本團(tuán)隊(duì)成功以DMDH和L-LeuDH為核心催化劑,構(gòu)建了能夠?qū)崿F(xiàn)輔酶內(nèi)循環(huán)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系,基于輔酶內(nèi)循環(huán),在不引入輔底物及額外催化劑的前提下,實(shí)現(xiàn)了L-苯甘氨酸的高效生物合成。200 mmol/L的D-扁桃酸在合適條件下反應(yīng)12 h,L-苯甘氨酸的得率可達(dá)98%,且對(duì)映體過量值(enantiomeric excess,e.e.)大于98%[7]。目前,生物催化常用的催化劑主要有酶、細(xì)胞器和微生物細(xì)胞[6],這3 種催化劑各有優(yōu)勢(shì)。其中,全細(xì)胞催化具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),尤其是在有氧化還原反應(yīng)參與的生物催化過程中,以微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行催化反應(yīng)可以利用細(xì)胞體內(nèi)的輔酶循環(huán)系統(tǒng),不需要額外添加輔酶;同時(shí),以全細(xì)胞作為生物催化劑能夠提高催化劑的穩(wěn)定性,減少催化劑的用量[22-24],且便于催化劑使用后的回收利用以及后續(xù)與產(chǎn)物的分離,能降低催化劑的使用成本及后續(xù)的分離成本[25]。迄今為止,全細(xì)胞催化技術(shù)用于工業(yè)化生產(chǎn)的案例也越來越多[26-28]。
本研究擬參照?qǐng)D1 的合成路線, 考察攜帶Agrobacterium radiobacter來源MR(ArMR)、Lactobacillus harbinensi來源DMDH(LhDMDH)和Exiguobacterium sibiricumDSM 17290來源LeuDH(EsLeuDH)編碼基因的重組大腸桿菌全細(xì)胞,對(duì)D,L-扁桃酸的轉(zhuǎn)化情況,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定,為實(shí)現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)模化的生物合成奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
圖1 全細(xì)胞催化生成L-苯甘氨酸的流程圖Fig. 1 Flow chart showing whole-cell catalytic production of L-phenylglycine
1.1.1 試劑
底物D,L-扁桃酸、L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG) 生工生物工程(上海)股份有限公司;甲醇(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氘代二甲亞砜 上海麥克林生化科技有限公司;NAD+深圳邦泰生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。
1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基
Escherichia coliBL21(DE3)、攜帶LhDMDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pET28a-LhDMDH[7]和ArMR基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pET28a-ArMR菌株[1]由本課題組構(gòu)建和保藏;攜帶EsLeuDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pETDuet-1-EsLeuDH[21]由許建和教授饋贈(zèng)。共表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1購自美國Invitrogen公司。LB培養(yǎng)基:10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉和5 g/L酵母提取物,自然pH值,121 ℃滅菌20 min,用于大腸桿菌的培養(yǎng)。
核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司;EC 2006型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng) 大連依利特分析儀器有限公司;Hypersil C18柱、LTQ Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) 美國Thermo Scientific公司;Chirobiotic T手性柱 美國Merck公司。
1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建
分別將質(zhì)粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,用割膠回收試劑盒回收酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1,用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。再分別將pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,用割膠回收試劑盒回收酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH,用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落PCR檢測(cè)、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定后獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后,將pET28a-ArMR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選,獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。
將上述重組菌連續(xù)在無抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次,然后接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察的生長情況,通過雙重抗性篩選考察重組菌攜帶質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性[1]。
1.3.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)
授課教師要根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行充分的分析、討論,如果課程達(dá)成度高于要求值,說明該課程可以實(shí)現(xiàn)對(duì)指標(biāo)點(diǎn)的支撐,如果課程達(dá)成度低于要求值,教師需要改進(jìn)教學(xué)方法和教學(xué)水平。專業(yè)負(fù)責(zé)人要根據(jù)畢業(yè)要求達(dá)成度進(jìn)行研究,如果個(gè)別指標(biāo)點(diǎn)達(dá)成度低于要求值,需要與相關(guān)教師尤其是勉強(qiáng)支撐課程的教師溝通,幫助教師提高教學(xué)水平,如果總的畢業(yè)要求達(dá)成度低于要求值,需要對(duì)課程體系進(jìn)行修訂。
重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)采用低溫、低誘導(dǎo)劑濃度的誘導(dǎo)策略進(jìn)行。分別將E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1和E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR單菌落接種至4 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h,2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)2.5 h,加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h;取10 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5 min,收集菌體,重懸后進(jìn)行超聲破碎,并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析[29]。
1.3.3 酶活性分析
DMDH氧化活性:以D-扁桃酸為底物,以NADH生成量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。MR活性:以L-扁桃酸為底物,根據(jù)文獻(xiàn)[7]用HPLC法測(cè)定D-扁桃酸的生成量,以此計(jì)算酶的消旋活性。L-LeuDH還原活性:以苯乙酮酸為底物、NADH為輔酶,加上合適的HN4+,30 ℃條件下用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)340 nm波長處吸光度的變化量[21]。
1.3.4 重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化D,L-扁桃酸合成L-苯甘氨酸
取50 mL上述誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-
ArMR,4 ℃、8 000 r/min離心5 min,收集菌體,重懸于10 mL 500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液中(pH 9.5),50 mmol/LD,L-扁桃酸,溫度30 ℃,反應(yīng)48 h后取1 mL轉(zhuǎn)化液于8 800×g離心1 min,取上清液,稀釋100 倍后用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾,最后用HPLC法檢測(cè)L-苯甘氨酸含量。
1.3.5L-苯甘氨酸的定性分析
先對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行普通C18柱的HPLC分析,HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱,檢測(cè)波長215 nm,柱溫30 ℃,流動(dòng)相為甲醇-水(20∶80,V/V),流速1 mL/min。然后,利用Chirobiotic T手性柱對(duì)產(chǎn)物及L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析,流動(dòng)相為甲醇-水-三氟乙酸(20∶80∶0.1,V/V),流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長254 nm,柱溫30 ℃,以此計(jì)算產(chǎn)物中L-苯甘氨酸的e.e.值。根據(jù)在相同分析條件下,產(chǎn)物在普通Thermo Hypersil C18柱以及Chirobiotic T手性柱中的保留時(shí)間,與L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行初步的定性分析。最后,將底物和產(chǎn)物委托基云(上海)生物技術(shù)有限公司,利用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析,進(jìn)一步基于質(zhì)荷比對(duì)其進(jìn)行定性分析。
1.3.6L-苯甘氨酸的定量分析
將L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液,然后分別取20 μL進(jìn)行HPLC分析,獲得各濃度L-苯甘氨酸的峰面積后,進(jìn)行線性擬合獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱,檢測(cè)波長215 nm,柱溫30 ℃,流動(dòng)相為甲醇-水(20∶80,V/V),流速1 mL/min。待檢樣品產(chǎn)物按照同樣的條件進(jìn)行HPLC分析,根據(jù)測(cè)得的峰面積可以由回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的樣品濃度。
圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進(jìn)行色階、對(duì)比度調(diào)節(jié)及標(biāo)注等處理,圖片中所用的化學(xué)式采用ChemDraw Ultra 8.0進(jìn)行繪制。簡單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9進(jìn)行。
按照1.3.1節(jié)方法將質(zhì)粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1進(jìn)行雙酶切,酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1經(jīng)電泳分離和割膠回收,再用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽性重組子。挑取陽性重組子用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖2A所示,片段長度約1 400 bp,大小與預(yù)期相符。進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果如圖2B所示,能夠釋放出與EsLeuDH長度一致的目的片段(約1 200 bp)。將經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證的重組子送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明EsLeuDH的序列及在載體上的插入位置與預(yù)期的完全一致,表明成功獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。
圖2 E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組子的菌液PCR檢測(cè)(A)及雙酶切驗(yàn)證(B)Fig. 2 PCR detection and double digestion detection of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH
同樣按照1.3.1節(jié)方法將質(zhì)粒pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH進(jìn)行雙酶切,酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH經(jīng)電泳分離和割膠回收,再用DNA連接試劑盒連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽性重組子。挑取陽性重組子用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖3A所示,片段長度約1 300 bp,大小與預(yù)期相符。進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果如圖3B所示,能夠釋放出與LhDMDH長度一致的目的片段(約1 100 bp)。將經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證的重組子送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示LhDMDH的序列及在載體上的插入位置與預(yù)期完全一致,表明成功獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后,將pET28a-ArMR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選,獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。重組菌連續(xù)在無抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次,接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),生長狀況良好,表明該重組菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性,攜帶的雙質(zhì)粒在傳代過程不會(huì)發(fā)生質(zhì)粒不相容的現(xiàn)象。
圖3 E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組子的菌液PCR檢測(cè)(A)及雙酶切驗(yàn)證(B)Fig. 3 PCR detection and double digestion verification of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH
分別將E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1、E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH和E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR菌株按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),將誘導(dǎo)后的菌液取10 mL離心收集,經(jīng)重懸和超聲破碎后進(jìn)行SDSPAGE及酶活性分析。如圖4所示,E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR的裂解上清液在38 kDa和40~43 kDa處有明顯的特異性條帶,分別與LhDMDH、EsLeuDH[20]和ArMR的理論分子質(zhì)量一致,表明3 個(gè)目標(biāo)酶均成功實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。結(jié)果顯示,經(jīng)換算后,發(fā)酵液中的LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。酶活性測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明,借助雙質(zhì)粒共表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了3 個(gè)目標(biāo)酶有活性形式的共表達(dá)。
圖4 重組大腸菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE profile of the expression products of recombinant E. coli
按照1.3.6節(jié)方法,將分析純的L-苯甘氨酸在Thermo Hypersil C18柱上進(jìn)行HPLC分析,在該分析條件下,L-苯甘氨酸的保留時(shí)間約為3.43 min(圖5A),將L-苯甘氨酸不同濃度值對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性擬合,獲得的L-苯甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出L-苯甘氨酸濃度對(duì)應(yīng)的回歸方程為y=0.000 2x-0.011,相關(guān)系數(shù)為0.999 0,結(jié)果表明在該HPLC分析條件及濃度范圍下,L-苯甘氨酸濃度與峰面積呈良好線性相關(guān),因此,利用此法可以對(duì)L-苯甘氨酸進(jìn)行精確定量分析。同樣條件下對(duì)底物D,L-扁桃酸進(jìn)行HPLC分析,底物的保留時(shí)間約為2.33 min(圖5B),這也說明D,L-扁桃酸的極性明顯大于L-苯甘氨酸。同時(shí),由于受D,L-扁桃酸極性的影響,且它的pH值比L-苯甘氨酸高,在與L-苯甘氨酸同樣的分析條件下不利于其有效分離,因此D,L-扁桃酸的色譜峰始終不能對(duì)稱(呈三角形)。而這一現(xiàn)象對(duì)產(chǎn)物鑒定的影響不大,且在與產(chǎn)物共存時(shí),D,L-扁桃酸的色譜峰反而能呈現(xiàn)較好的對(duì)稱性。
圖5 L-苯甘氨酸(A)及D,L-扁桃酸(B)在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 5 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D,L-mandelic acid (B) on Thermo Hypersil C18 column
按照1.3.4節(jié)方法對(duì)D,L-扁桃酸進(jìn)行全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化。在D,L-扁桃酸的初始濃度為50、500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液(pH 9.5)的條件下,180 r/min、30 ℃反應(yīng)48 h后,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過離心取樣稀釋100 倍后,按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如圖6所示。在保留時(shí)間約為3.43 min的位置有明顯特征峰,它與相同分析條件下L-苯甘氨酸的保留時(shí)間一致(圖5A),表明在該反應(yīng)條件下有L-苯甘氨酸的生成,經(jīng)過計(jì)算其得率約為77.48%,較低的得率及底物濃度有待下一步對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
圖6 催化產(chǎn)物在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 6 HPLC profile of catalytic products on Thermo Hypersil C18 column
將底物及純化產(chǎn)物送至基云(上海)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖7、8所示。在圖7中,由質(zhì)荷比可以推出物質(zhì)的分子式可能為C8H8O3Na+[M+Na]+,表明該物質(zhì)是C8H8O3(扁桃酸)結(jié)合了1 個(gè)Na+;在圖8中,由質(zhì)荷比可以推出物質(zhì)的分子式可能為C8H10NO2+[M+H]+,表明該物質(zhì)是C8H9NO2(苯甘氨酸)結(jié)合了一個(gè)H+。
圖7 底物的高分辨質(zhì)譜分析Fig. 7 High-resolution mass spectrum of the substrate
圖8 產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜分析Fig. 8 High-resolution mass spectrum of the product
圖9 L-苯甘氨酸(A)及D-苯甘氨酸(B)在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 9 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D-phenylglycine (B)on Chirobiotic T chiral C18 column
用Chirobiotic T手性柱參照1.3.5節(jié)方法對(duì)L-苯甘氨酸、D-苯甘氨酸及純化產(chǎn)物進(jìn)行手性柱的HPLC分析,L-苯甘氨酸和D-苯甘氨酸的保留時(shí)間分別約為7.40 min和8.91 min(圖9),大部分產(chǎn)物的保留時(shí)間在7.40 min左右(圖10),在8.91 min左右的峰面積較小。結(jié)合普通C18柱HPLC分析及高分辨質(zhì)譜的分析結(jié)果,進(jìn)一步表明該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終產(chǎn)物主要為L-苯甘氨酸,且其e.e.值大于99%,該級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有較高的對(duì)映體選擇性。本研究與Liu Qiaoli等[14]設(shè)計(jì)的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達(dá)體系相比較,不需要額外添加甲酸鈉之類的輔底物,另外,外消旋扁桃酸相對(duì)苯乙酮酸來說也更廉價(jià)、更易得,具有更大的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
圖10 純化產(chǎn)物在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 10 HPLC profile of purified product on Chirobiotic T chiral C18 column
隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展,利用2 個(gè)或更多酶進(jìn)行多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在手性純的化學(xué)品的合成中更受青睞[30]。通常這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以用全細(xì)胞、細(xì)胞裂解液或游離酶作催化劑。與其他2 個(gè)相比,全細(xì)胞催化具有更多的優(yōu)點(diǎn),包括催化劑更穩(wěn)定、更易回收利用,在一些氧化還原反應(yīng)中無需添加輔酶等。因此,共表達(dá)多個(gè)酶的全細(xì)胞催化已被廣泛用于眾多化學(xué)品的生物合成。
本研究成功構(gòu)建了攜帶LhDMDH、EsLeuDH和ArMR編碼基因的重組大腸桿菌,重組菌的遺傳穩(wěn)定性良好。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,發(fā)酵液中LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。共表達(dá)時(shí),3 個(gè)酶各自的表達(dá)水平與單獨(dú)表達(dá)時(shí)差別不大,進(jìn)一步表明大腸桿菌具有強(qiáng)大的表達(dá)外源蛋白能力。此外,以誘導(dǎo)后的全細(xì)胞為催化劑、D,L-扁桃酸為底物,實(shí)現(xiàn)了L-苯甘氨酸高對(duì)映選擇性的生物合成,在測(cè)定條件下L-苯甘氨酸的得率可達(dá)77.48%,e.e.值大于99%。與Liu Qiaoli等[14]設(shè)計(jì)的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達(dá)體系相比,不需要額外的添加甲酸鈉之類的輔底物,另外,D,L-扁桃酸相對(duì)苯乙酮酸也更廉價(jià)、更易得,具有更大的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。本研究具有較大的產(chǎn)業(yè)化潛力,為實(shí)現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)?;纳锖铣傻於藞?jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。