趙翠敏，杜 芳，鄒亞杰，胡清秀，鄭素月

（1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，每年都會(huì)有大量的秸稈類、修枝類等農(nóng)林廢棄物產(chǎn)生。這些農(nóng)林廢棄物大多富含木質(zhì)纖維素，是來(lái)源豐富、成本低廉、再生時(shí)間短的生物質(zhì)資源，其堆積不僅會(huì)造成環(huán)境污染，而且是一種巨大的資源浪費(fèi)[1-2]。食用菌屬于大型真菌，可以以富含木質(zhì)纖維素的材料為主要培養(yǎng)料[3]，通過(guò)分泌一系列胞外酶將纖維素和半纖維素物質(zhì)分解為可供菌體直接吸收利用的小分子碳源。但在木質(zhì)纖維素中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互交聯(lián)，形成牢固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。纖維素及半纖維素很容易被環(huán)境中的微生物降解，但木質(zhì)素卻不容易被分解。降解木質(zhì)素能有效地促進(jìn)纖維素、半纖維素的釋放，是木質(zhì)纖維素物質(zhì)高效利用的關(guān)鍵。參與木質(zhì)素降解的酶系主要由木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）、錳過(guò)氧化物酶（manganese peroxidase,MnP）和漆酶（laccase）等組成，這些酶類合稱為木質(zhì)素降解酶或木質(zhì)素酶[5-6]。

刺芹側(cè)耳 [Pleurotus eryngii(DC.et Fr.)Quèl.]，又名杏鮑菇，隸屬于傘菌目（Agaricales） 側(cè)耳科（Pleurotaceae） 側(cè)耳屬 （Pleurotus），是一種白腐真菌，具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力，可以在木屑、甘蔗渣、棉籽殼、玉米芯等多種農(nóng)林廢棄物上生長(zhǎng)[7]。真菌對(duì)基質(zhì)的利用和轉(zhuǎn)化能力可以用其木質(zhì)纖維素降解酶的活性來(lái)指示。鞠洪波[8]研究報(bào)道杏鮑菇對(duì)云杉木質(zhì)素的降解能力在香菇、金針菇、平菇等9種食用菌中最強(qiáng)，而從多種新鮮食用菌子實(shí)體中提取漆酶，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇漆酶的酶活性最高[9-10]，工廠化杏鮑菇菌渣漆酶活性最高可以達(dá)到7.55×104U·g-1，明顯高于桃紅側(cè)耳、香菇、白靈菇菌渣中的漆酶活性[11]。由此可見(jiàn)，杏鮑菇之所以生長(zhǎng)速度快、生產(chǎn)周期短、易于栽培，除了其本身的生物學(xué)特性之外，還與其能夠分泌高活性的木質(zhì)素酶類緊密關(guān)聯(lián)[12]。但在杏鮑菇的生產(chǎn)過(guò)程中，不同農(nóng)林廢棄物誘導(dǎo)菌絲體生產(chǎn)木質(zhì)素酶類的酶活水平尚不清楚。通過(guò)以刺芹側(cè)耳2611為試驗(yàn)材料，研究其在7種農(nóng)林廢棄物培養(yǎng)基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速度，并且測(cè)定其液體發(fā)酵胞外產(chǎn)漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的情況變化，探索刺芹側(cè)耳對(duì)不同栽培基質(zhì)的降解利用規(guī)律，為優(yōu)化刺芹側(cè)耳新型栽培基質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）2611，來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)ACCC52611。

1.1.2 供試材料

棉籽殼、木屑、玉米芯、玉米秸稈、甘蔗渣、花生殼、檸條7種農(nóng)林廢棄物，各栽培基質(zhì)中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量[13-16]如表1所示。

表1 供試原料及組成Tab.1 Test material and composition

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：15.6 g DifcoTM Potato Dextrose A－gar（美國(guó) BD公司） 溶于 400 mL的 ddH2O中，121℃滅菌 15 min。

農(nóng)林廢棄物培養(yǎng)基各組分見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基組分Tab.2 The medium formula

如表2所示，固體和液體培養(yǎng)基組分相同，固體培養(yǎng)基配制時(shí)加入20 g·L-1的瓊脂。定容至1 L，121℃，滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 平板培養(yǎng)試驗(yàn)

從PDA平板上取0.5 cm×0.5 cm菌種塊接種于不同基質(zhì)的固體培養(yǎng)基的平板。28℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d觀察記錄菌絲生長(zhǎng)情況，并測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)

在250 mL的三角瓶中加入100 mL相應(yīng)的發(fā)酵液滅菌，在無(wú)菌環(huán)境中每瓶接種10 mL的原種，置于28℃搖床內(nèi)黑暗振蕩（180 r·min-1）培養(yǎng)5 d。原種由2個(gè)剛長(zhǎng)滿菌絲90 mm×90 mm PDA平板加入100 mL農(nóng)林廢棄物培養(yǎng)基中，經(jīng)勻漿儀20 s混勻得到。

1.2.3 粗酶液制備

將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液樣品。

1.2.4 漆酶活性測(cè)定

ABTS法測(cè)定發(fā)酵液漆酶酶活[17]。將100 μL的粗液樣品與190 μL的底物ABTS混勻，30℃反應(yīng)10 min后，加入300 μL的5℅ TCA溶液終止反應(yīng)，420 nm處測(cè)定OD值。滅活酶液作為對(duì)照，對(duì)照管提前終止。酶活單位定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U·mL-1），漆酶活力（E，U·mL-1）計(jì)算公式為：

式中：ε為ABTS摩爾消光系數(shù)（36 000 L·mol-1cm-1）；Δt為酶反應(yīng)時(shí)間（min）；ΔOD為吸光度的變化值；V1為酶反應(yīng)中反應(yīng)液的總體積（mL）；V2為酶反應(yīng)中，酶液的總體積（mL）；N為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性測(cè)定

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定使用北京索萊寶生物科技有限公司的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶試劑盒。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1 nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性（P，nmol·min-1L-1）計(jì)算公式為：

式中：ε為藜蘆醛摩爾消光系數(shù)，9 300 L·mol-1cm-1；d為比色皿光徑1 cm；V反總為反應(yīng)總體積1 mL；V樣為反應(yīng)中樣本體積0.1 mL；T為反應(yīng)時(shí)間5 min；ΔA為OD310的變化值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

生長(zhǎng)速度、酶活和生物量變化數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），小寫(xiě)字母為使用IBM SPSS Statistics 25軟件計(jì)算的顯著性差異（P<0.05），采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同栽培基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)和菌絲的濃密度不同，見(jiàn)圖1、表3。

表3 不同基質(zhì)對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.3 The effects of different media on mycelium growth

從圖1、表3可以看出，在玉米芯基質(zhì)上，菌絲生長(zhǎng)速度最快（5.49 mm·d-1），且菌絲整齊濃密，長(zhǎng)勢(shì)良好；其次菌絲生長(zhǎng)速度由快到慢依次是玉米秸稈、甘蔗渣、木屑、花生殼、檸條、棉籽殼。其中玉米秸稈基質(zhì)生長(zhǎng)速度（4.96 mm·d-1）和甘蔗渣基質(zhì)生長(zhǎng)速度（4.84 mm·d-1）差異不顯著，木屑基質(zhì)生長(zhǎng)速度（4.63 mm·d-1）和花生殼基質(zhì)（4.62 mm·d-1）沒(méi)有顯著差異。甘蔗渣基質(zhì)上菌絲稀疏，菌絲較均勻。綜合菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲濃密度、菌絲均勻度分析，以棉籽殼、檸條、甘蔗渣為碳源的培養(yǎng)基質(zhì)杏鮑菇的菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于以其他材料為碳源基質(zhì)的杏鮑菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)，說(shuō)明以玉米芯、木屑、玉米秸稈和花生殼為碳源有利于菌絲的生長(zhǎng)，杏鮑菇對(duì)4種基質(zhì)的降解利用效果更好。

2.2 不同培養(yǎng)基質(zhì)誘導(dǎo)菌絲體產(chǎn)漆酶的能力比較

不同培養(yǎng)基質(zhì)液體發(fā)酵液中的漆酶酶活性有顯著的差異，見(jiàn)表4。

表4 不同基質(zhì)對(duì)漆酶酶活的影響Tab.4 The effects of different substrates on laccase activity

從表4可以看出，在花生殼培養(yǎng)基質(zhì)中，漆酶的酶活最高（109.15 U·mL-1），其它培養(yǎng)基質(zhì)中漆酶酶活由高到低依次是玉米秸稈、玉米芯、木屑、檸條、甘蔗渣、棉籽殼，在棉籽殼培養(yǎng)基質(zhì)中漆酶酶活最低（30.08 U·mL-1）。其中玉米芯基質(zhì)中的漆酶酶活（76.62 U·mL-1）與玉米秸稈基質(zhì)中的漆酶酶活（86.62 U·mL-1）無(wú)顯著差異，木屑基質(zhì)中的漆酶酶活（63.73 U·mL-1）與檸條基質(zhì)中的漆酶酶活（57.60 U·mL-1）差異也不顯著。白腐菌的生長(zhǎng)與漆酶的分泌具有一定的相關(guān)性，一般情況下，生長(zhǎng)狀況良好的白腐菌分泌的漆酶酶活性高，生長(zhǎng)狀況差的白腐菌分泌的漆酶酶活性低，但是白腐菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)漆酶并不同步，沒(méi)有明顯的正相關(guān)性[18]。在本研究中，杏鮑菇在花生殼、玉米秸稈、玉米芯基質(zhì)中分泌漆酶的酶活性高，而在棉籽殼、檸條、甘蔗渣基質(zhì)中分泌胞外漆酶的酶活性低。和已有的研究結(jié)果基本一致，漆酶的酶活性與菌絲長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)越好漆酶酶活越高[19]。

2.3 不同培養(yǎng)基質(zhì)誘導(dǎo)菌絲體產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的能力比較

不同培養(yǎng)基質(zhì)液體發(fā)酵液中的的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性有顯著的差異，見(jiàn)表5。

表5 不同基質(zhì)對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活的影響Tab.5 The effects of different substrates on lignin peroxidase activity

從表5可以看出，在玉米芯培養(yǎng)基質(zhì)中，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性最高（6.02 nmol·min-1L-1）。其它培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性由高到低依次是玉米秸稈、花生殼、棉籽殼、木屑、甘蔗渣、檸條。其中玉米芯培養(yǎng)基質(zhì)中的酶活性（6.02 nmol·min-1L-1）與玉米秸稈培養(yǎng)基質(zhì)中的酶活性（5.23 nmol·min-1L-1）無(wú)顯著差異，甘蔗渣培養(yǎng)基質(zhì)中的酶活性（0.86 nmol·min-1L-1）與檸條培養(yǎng)基質(zhì)中的酶活性（0.26 nmol·min-1L-1）無(wú)顯著差異。檸條培養(yǎng)基質(zhì)中酶活性最低（0.26 nmol·min-1L-1）。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性在檸條、甘蔗渣、木屑、棉籽殼的培養(yǎng)基中，活性明顯低于其它培養(yǎng)基。以上結(jié)果表明，胞外木質(zhì)素過(guò)氧化物的酶活性與菌絲長(zhǎng)勢(shì)具有一定的相關(guān)性，酶活越高菌絲長(zhǎng)勢(shì)越好。

3 討論

通過(guò)對(duì)刺芹側(cè)耳在不同培養(yǎng)基質(zhì)上菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲的長(zhǎng)勢(shì)和胞外酶的變化規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)和木質(zhì)素降解酶的活性均有明顯影響（P<0.05）。菌絲長(zhǎng)勢(shì)參差不齊、菌絲生長(zhǎng)速度差異大，在玉米芯基質(zhì)上菌落最大，菌絲濃密，其次是玉米秸稈基質(zhì)，說(shuō)明玉米的廢棄物適合刺芹側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng)。已有研究表明食用菌菌絲的生長(zhǎng)速度不僅與栽培料的C/N和N濃度有關(guān)，更與栽培料種類及其透氣性密切相關(guān)；菌絲生長(zhǎng)良好是食用菌高產(chǎn)的基礎(chǔ)，但是不同栽培基質(zhì)的菌絲滿袋時(shí)間及菌絲濃密度與其產(chǎn)量相關(guān)性不顯著，菌絲的生長(zhǎng)情況與產(chǎn)量不呈正相關(guān)[20-22]。根據(jù)本研究結(jié)果，可以在杏鮑菇的生產(chǎn)中栽培基質(zhì)中加入合適比例的玉米芯和玉米秸稈將有助于菌絲的生長(zhǎng)。

漆酶是與木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解有關(guān)的主要酚氧化酶，在木質(zhì)素的分解過(guò)程中起著重要的作用，屬于誘導(dǎo)酶類，其活性會(huì)受到諸多因素的影響，如碳源、氮源、金屬離子和激活物、pH及菌株等[20]。雜木屑、棉籽殼、玉米芯、甘蔗渣都是食用菌生產(chǎn)的主要碳源，其都含有大量的木質(zhì)素，但含量不同，木質(zhì)素含量高更有利于漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)[23]。韓嘉鈺等[24]對(duì)不同栽培基質(zhì)對(duì)靈芝胞外酶活的影響開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)在菌絲生長(zhǎng)階段玉米芯培養(yǎng)基質(zhì)中漆酶的酶活性比棉籽殼和木屑中的漆酶酶活性要高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。趙風(fēng)云等[25]研究以蔗渣和棉籽殼為基質(zhì)的靈芝酶活性中，發(fā)現(xiàn)棉籽殼培養(yǎng)基質(zhì)中的漆酶酶活性高于蔗渣，與本試驗(yàn)中甘蔗渣漆酶酶活性高于棉籽殼結(jié)果不一致。安琪等[26]針對(duì)不同碳源和氮源開(kāi)展對(duì)金針菇降解木質(zhì)纖維素酶活性的影響的研究，表明與纖維素酶和半纖維素酶相反，金針菇在復(fù)雜氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)漆酶活性相應(yīng)低于簡(jiǎn)單氮源培養(yǎng)基。在本研究中，花生殼培養(yǎng)基質(zhì)中漆酶的酶活性最高（109.15 U·mL-1），棉籽殼基質(zhì)中漆酶酶活最低（30.08 U·mL-1）。花生殼的木質(zhì)素含量最高，菌絲生長(zhǎng)需要分泌更多的漆酶來(lái)降解木質(zhì)素，因此在花生殼培養(yǎng)基質(zhì)中酶活最高。但是棉籽殼的木質(zhì)素含量在7種農(nóng)林廢棄物中不是最低的。木質(zhì)素含量只是其中一個(gè)因素，不是決定性的因素，可能還和栽培基質(zhì)的結(jié)構(gòu)等其它因素有關(guān)。

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是第一個(gè)從黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium） 發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶，在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵性作用[27]。丁少軍等[28]研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)云芝木質(zhì)素降解酶產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶的產(chǎn)生與培養(yǎng)條件關(guān)系很大。彭木等[29]在研究帽兒山采集的禪剝管菌時(shí)表明不同底物能極大地刺激相應(yīng)酶的產(chǎn)生與分泌。據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素含量越高越能促進(jìn)木質(zhì)素分解酶的產(chǎn)生[30]。在本研究中，玉米芯培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性達(dá)到最高（6.02 nmol·min-1L-1），檸條培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性最低（0.26 nmol·min-1L-1）?？傮w來(lái)看，除了少數(shù)差異以外，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性與漆酶的酶活性表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

綜上所述，通過(guò)對(duì)刺芹側(cè)耳在不同培養(yǎng)基質(zhì)上菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、長(zhǎng)速分析并進(jìn)行了對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)，測(cè)定了木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，初步明確了不同種類的農(nóng)林廢棄物的木質(zhì)纖維素的組成影響刺芹側(cè)耳的降解能力，哪種類型的農(nóng)林廢棄物更有利于刺芹側(cè)耳的吸收利用，為進(jìn)一步篩選適宜刺芹側(cè)耳利用生長(zhǎng)的栽培基質(zhì)提供參考。