周家萍，孟夢(mèng)，夏國(guó)強(qiáng)

（1.天津科技大學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，天津 300457；4.優(yōu)滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

中國(guó)擬青霉（Paecilomyces sinensis sp nov，PS）是從蟲草中分離后，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的無(wú)性型菌株[1]。并且中國(guó)擬青霉與天然蟲草相比，藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)[2]及所含的有效化學(xué)成分極為相似[3]。因此從中國(guó)擬青霉中分離出具有生物活性的菌體對(duì)蟲草的研究與應(yīng)用具有非常重要的意義。與傳統(tǒng)的食藥用真菌生產(chǎn)方式相比，真菌液體深層發(fā)酵技術(shù)有更為明顯的優(yōu)點(diǎn)[4]。研究人員對(duì)真菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)后，通過(guò)對(duì)其菌絲體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明其菌絲體與該真菌的野生型子實(shí)體相比，生物活性物質(zhì)的組成十分相似[5]。在真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，不僅菌絲體會(huì)大量增殖，其發(fā)酵液中也會(huì)產(chǎn)生很多生理活性物[6]。因此，研究真菌液體深層發(fā)酵技術(shù)的意義重大[7]。本文以中國(guó)擬青霉為原材料，研究其培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件不同對(duì)中國(guó)擬青霉液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的影響，從而優(yōu)化了中國(guó)擬青霉液體深層發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國(guó)擬青霉（Paecilomyces sinensis）：保存于天津科技大學(xué)菌種保藏中心。

葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、氯化銨、硝酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、三氟乙酸：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、冰醋酸、無(wú)水葡萄糖、鹽酸：分析純，天津化學(xué)試劑一廠；Sepharose 4B：上海Pharmacia拜力公司；透析袋（COMW 7000）：北京Sorlabio生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ810C高壓蒸汽滅菌鍋：日本雅瑪拓公司；DGG-102-2BS電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；FE28 pH測(cè)定計(jì)：瑞士Mettler Toledo有限公司；BSA822電子天平：美國(guó)Sartorius公司；EPOCH酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；SP88857195磁力攪拌器：美國(guó)Thermo Fisher公司；Vortex渦旋振蕩混合器：德國(guó)IKA公司；KQ5200DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；5920R冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；UV-2550PC紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及培養(yǎng)

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上接種保存的中國(guó)擬青霉母種，將其置于25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿斜面后備用。從斜面上挑取活化好兩塊菌絲體，將其接入到裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25℃的搖床上振蕩，從而獲取一級(jí)種子液。將菌絲體打碎，將一級(jí)種子液接入到裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25℃的搖床上振蕩4 d，從而獲取二級(jí)種子液。最后將種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，將其置于25℃的搖床中振蕩培養(yǎng)5 d。

1.3.2 中國(guó)擬青霉液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.2.1 碳源、氮源的單因素篩選試驗(yàn)

碳源篩選試驗(yàn)：葡萄糖分別以4.0%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、果糖替代；氮源篩選試驗(yàn)：蛋白胨分別以酵母粉、黃豆粉、麩皮、硝酸銨、氯化銨替代，含量以0.5%蛋白胨的全氮含量計(jì)。各組設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2.2 碳源、氮源正交試驗(yàn)

根據(jù)碳源與氮源的單因素篩選的結(jié)果，選擇試驗(yàn)結(jié)果較好的碳源、氮源各兩個(gè)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)條件同1.3.2.1，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，如表1所示。

表1 碳源、氮源正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Scheme of carbon and nitrogen source in orthogonal test

1.3.2.3 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)

根據(jù)最佳碳源、氮源培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果，選取KH2PO4、MgSO4、CaSO4、ZnSO4，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，發(fā)酵條件同1.3.2.1，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，如表2所示。

表2 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Scheme of inorganic saltin in orthogonal test

1.3.3 菌絲體生物量的測(cè)定

首先過(guò)濾液體發(fā)酵所得菌體，再用蒸餾水反復(fù)漂洗菌體，將洗好的菌體放置于預(yù)處理好的玻璃平皿上，在60℃恒溫的鼓風(fēng)干燥箱干燥至質(zhì)量不發(fā)生改變?yōu)橹?，將其放在分析天平稱重，然后減去玻璃平皿的質(zhì)量，即為發(fā)酵液菌體的質(zhì)量，最后除以該發(fā)酵液的體積，即為生物量。每組重復(fù)3次，取平均值[8]。

1.3.4 胞內(nèi)糖肽的測(cè)定

1.3.4.1 胞內(nèi)糖肽的提取

將烘干的菌絲體粉碎，過(guò)篩后稱取1.0 g，加入100 mL的蒸餾水，在90℃條件下水浴提取2 h，然后7 000 r/min離心20 min，取上清液，50℃條件下進(jìn)行旋蒸，加入無(wú)水乙醇，在4℃條件下放置24 h進(jìn)行醇沉，6 000 r/min離心15 min，沉淀經(jīng)sevage法除蛋白沉淀60℃真空干燥至恒重，即得中國(guó)擬青霉胞內(nèi)糖肽粗品，命名為CPS-Ⅰ。

1.3.4.2 糖含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取干燥的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成50 mL的100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 放于具塞比色管中，以超純水補(bǔ)至1mL，然后加入6%苯酚500μL，混勻，迅速加入濃硫酸2.5 mL，搖勻后沸水浴處理15 min，冷水浴冷卻后于490 nm處測(cè)吸光度，以葡聚糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=4.577 9x+0.004（R2=0.999）。

圖1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucanase

1.3.4.3 換算系數(shù)的計(jì)算

糖肽粗品組成成分不單一，單糖組分也不單一，這些單糖經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后吸光度也不完全一樣，而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)采用的是單一葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，這樣會(huì)存在一定的誤差，因此需用換算因子f加以校正。

理論CPS-Ⅰ質(zhì)量：稱取5mgCPS-Ⅰ定容至50mL，分別取1.0 mL到3支具塞試管中，按1.3.4.2方法顯色，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以1.0 mL蒸餾水為空白。最后根據(jù)回歸方程計(jì)算理論CPS-Ⅰ含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳源的選擇

碳源對(duì)中國(guó)擬青霉液體發(fā)酵的影響見圖2。

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要優(yōu)化因素之一，同時(shí)也是細(xì)胞生命活動(dòng)所需的主要能量來(lái)源[9]。由圖2可知，中國(guó)擬青霉菌絲體都可利用這6種碳源，表明中國(guó)擬青霉既可利用復(fù)合碳源，也可利用小分子碳源。其中以菌絲體生物量為指標(biāo)時(shí)，以玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉最佳，分別為6.19、5.37 mg/mL和4.81 mg/mL，其次是麥芽糖和蔗糖，分別為3.25 mg/mL和2.42 mg/mL，果糖最少，為1.28 mg/mL。以胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量為指標(biāo)時(shí)，玉米粉和葡萄糖較佳，分別為0.957、0.891 mg/mL，其次是可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖和果糖，分別為0.837、0.721、0.062 3 mg/mL和0.045 8 mg/mL。由于玉米粉價(jià)格低，來(lái)源廣，因此最終選擇玉米粉；同時(shí)菌體可直接利用葡萄糖，將發(fā)酵周期縮短。因此最終選擇玉米粉、葡萄糖作為正交試驗(yàn)中的碳源。

圖2 碳源對(duì)中國(guó)擬青霉液體發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of carbon sources on liquid fermentation of Paecilomyces sinensis

2.2 最佳氮源的選擇

氮源對(duì)中國(guó)擬青霉液體發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 氮源對(duì)中國(guó)擬青霉液體發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on liquid fermentation of Paecilomyces sinensis

有研究表明絕大多數(shù)的真菌培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵后，與含無(wú)機(jī)氮源（硝酸鹽、銨鹽）的培養(yǎng)基相比，生物量和產(chǎn)量均得到一定程度的提升[10]。從圖3可以看出，中國(guó)擬青霉在含酵母粉、黃豆粉、蛋白胨、麩皮的培養(yǎng)基中均能得到較好的生長(zhǎng)，而在含氯化銨、硝酸銨的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較為緩慢，說(shuō)明中國(guó)擬青霉對(duì)有機(jī)氮的利用比無(wú)機(jī)氮好。以菌絲體生物量和胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量為指標(biāo)，以酵母粉作為氮源時(shí)效果最佳，分別為3.25、0.853 mg/mL，其次為黃豆粉，分別為2.78、0.741 mg/mL。由于黃豆粉價(jià)格低，來(lái)源廣，因此最終選擇黃豆粉，同時(shí)酵母粉作為生長(zhǎng)因子，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有利并能夠使發(fā)酵周期有效縮短。因此，選擇黃豆粉和酵母粉作為氮源進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 碳源、氮源最佳組合的確定

碳、氮源正交試驗(yàn)的結(jié)果見表3。以菌絲體生物量為指標(biāo)的碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析見表4，以胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)的碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析見表5。

表3 碳、氮源正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments on carbon and nitrogen sources

表4 以菌絲體生物量為指標(biāo)的碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 4 Analysis of orthogonal test on carbon and nitrogen sources with mycelial biomass as target

選取玉米粉（A）、葡萄糖（B）、黃豆粉（C）和酵母粉（D）作為正交試驗(yàn)中的因素，從而篩選出培養(yǎng)基中碳源、氮源的最佳組合。由表3的結(jié)果可以看出，不同組合的選擇導(dǎo)致發(fā)酵的結(jié)果也不同。觀察表4、表5中極差分析可見，以菌絲體生物量為指標(biāo)，極差順序?yàn)榻湍阜郏居衩追郏军S豆粉＞葡萄糖，極差數(shù)據(jù)為0.99、0.94、0.67、0.36。以胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)，極差順序?yàn)榻湍阜郏居衩追郏酒咸烟牵军S豆粉，極差數(shù)據(jù)為0.35、0.31、0.26、0.21。兩種指標(biāo)均表明酵母粉的濃度是對(duì)發(fā)酵影響最大的因素。對(duì)菌絲體生物量而言，應(yīng)該選擇A2B2C3D3組合。以胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量而言，應(yīng)選擇A2B2C2D3組合。由于黃豆粉（C）的影響對(duì)發(fā)酵的影響作用較小，故選擇組合A2B2C3D3或者A2B2C2D3相差并不大，但考慮到降低試驗(yàn)成本，因此選擇黃豆粉（C）的水平為C2，試驗(yàn)最終選擇組合A2B2C2D3，即玉米粉4.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.3%。在此最優(yōu)組合下，菌絲體生物量為10.78 mg/mL，胞內(nèi)糖肽為1.701 2 mg/mL。

表5 以胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)的碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 5 Analysis of orthogonal test on carbon and nitrogen sources with glycopeptides as target

2.4 無(wú)機(jī)鹽最佳組合的確定

在確定碳源、氮源最佳組合后，選擇KH2PO4（E）、MgSO4（F）、CaSO4（G）、ZnSO4（H）4種無(wú)機(jī)鹽作為正交試驗(yàn)中的因素，從而篩選出無(wú)機(jī)鹽的最佳組合。正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。以菌絲體生物量和胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)的正交試驗(yàn)極差分析見表7和表8。

由表6結(jié)果可知，不同組合的選擇導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)果也是不同的。由表7、表8的極差分析可見，以菌絲體生物量為指標(biāo)，極差順序?yàn)?CaSO4＞KH2PO4＞MgSO4＞ZnSO4，極差數(shù)據(jù)為 0.61、0.51、0.40、0.29。以胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)，極差順序?yàn)?KH2PO4＞MgSO4＞CaSO4＞ZnSO4，極差數(shù)據(jù)為0.16、0.12、0.07、0.04。結(jié)果表明在中國(guó)擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中，CaSO4的濃度是對(duì)菌絲體生物量的影響最大的因素，而KH2PO4的濃度是對(duì)胞內(nèi)糖肽得率的影響最大的因素。對(duì)菌絲體生物量而言，應(yīng)當(dāng)選擇組合E2F2G3H3，對(duì)胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量而言，應(yīng)當(dāng)選擇組合E2F2G1H3。由極差順序可知，CaSO4的濃度對(duì)發(fā)酵的影響作用較小，因此選擇組合E2F2G3H3、E2F2G1H3相差不大，考慮到降低試驗(yàn)成本，因此選擇CaSO4（G）的水平選擇為G1，最終確定組合E2F2G1H3，選擇無(wú)機(jī)鹽的配比為：KH2PO40.2%，MgSO40.1%，CaSO40.1%，ZnSO40.03%。在此最優(yōu)組合下，菌絲體生物量為11.02 mg/mL，胞內(nèi)糖肽為2.012 5 mg/mL。

表6 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 6 Results of orthogonal tests on inorganic salts

表7 以菌絲體生物量為指標(biāo)的無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 7 Analysis of orthogonal test on inorganic salt with mycelial biomass as target

表8 以胞內(nèi)糖肽為指標(biāo)的無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 8 Analysis of orthogonal test on inorganic salt with glycopeptides as target

3 結(jié)論

本文對(duì)中國(guó)擬青霉液體深層發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以發(fā)酵獲取的菌絲體生物量和胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量為指標(biāo)，通過(guò)單因素篩選試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行篩選，確定了中國(guó)擬青霉液體深層發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基配比為玉米粉4.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉 0.3%、KH2PO40.2%，MgSO40.1%，CaSO40.1%，ZnSO40.03%。本試驗(yàn)在進(jìn)行接種前將制備好的所有種子液混合到一個(gè)三角瓶中，然后將其接種到優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基分別發(fā)酵5 d。優(yōu)化后的菌絲體生物量與優(yōu)化前相比提高了1.22倍，而胞內(nèi)糖肽產(chǎn)量與優(yōu)化前相比提高了54.0%。