周杏榮，周佳豪，雷文平，葉望娟，周 輝，劉成國

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128）

不同乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）對生長條件的要求存在較大差異，對從自然界中篩選的LAB進行人工培養(yǎng)存在一個適應過程，因此對篩選LAB的最佳培養(yǎng)條件有必要進行系統(tǒng)研究。高密度培養(yǎng)技術（high cell density culture，HCDC）是制備益生乳酸菌制劑關鍵技術之一，主要是指LAB在液體培養(yǎng)基中，通過可靠的培養(yǎng)技術和設備將菌體密度提升至傳統(tǒng)培養(yǎng)手段10倍以上的培養(yǎng)技術[1-2]。與常規(guī)培養(yǎng)技術相比，HCDC不僅可以獲得較高菌株菌體密度，而且能夠降低菌株培養(yǎng)成本和縮短生產(chǎn)周期[3-4]。影響LAB高密培養(yǎng)的因素較多，包括培養(yǎng)基的成分（碳源、氮源、無機鹽和生長因子）和基礎培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液pH值、溶氧濃度）等[5-7]。

為了獲取較高活性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），并為進一步制備高活菌數(shù)的菌劑提供優(yōu)良發(fā)酵菌液。本研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，并以活菌數(shù)和OD600nm值為考核指標，探究培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件（初始pH值、接種量）對L.caseiLZ183E活性的影響，確定菌株的最佳生長條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LZ183E：篩選自南方山區(qū)高山牧場中，保藏于湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院功能乳制品實驗室。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、吐溫-80、低聚果糖、L-抗壞血酸鈉、胰蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏粉、大豆蛋白胨、甘油：國藥集團化學試劑有限公司；萄糖漿、果葡糖漿：河南一凡生物科技有限公司；番茄汁：新鮮番茄洗凈后直接打漿，用紗布過濾，收集濾液；南瓜汁：新鮮南瓜去皮去核切塊，南瓜與水質(zhì)量比為1∶1混合后打漿，用紗布過濾，收集濾液。所用試劑均為國產(chǎn)分析純或生物試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉5 g/L，酵母膏粉4g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-801mL/L，磷酸氫二鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸三銨2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，最終pH值為6.2。固體培養(yǎng)基添加瓊脂15 g/L。

1.2 儀器與設備

FA2104型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；GZ-400-S型恒溫培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司；SW-CJ-2D型雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BKQ-B50II型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科科學儀器有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MDF-86V408型醫(yī)用-80 ℃低溫保存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1L.caseiLZ183E的活化

將在-80 ℃冰箱中保存的菌液接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，重復活化3次。

1.3.2 生長曲線的測定

將活化的菌株LZ183E接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，并在不同培養(yǎng)溫度條件下（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃和41 ℃）進行培養(yǎng)，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、32 h、40 h和48 h測定菌液的OD600nm值，然后以不同時間段時的OD600nm值與接種0 h時的OD600nm值差值（ΔOD600nm）作圖，繪制其生長曲線[8]。

1.3.3 高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗[9-12]

分別以20 g/L葡萄糖、葡萄糖漿、果葡糖漿、乳糖、蔗糖和麥芽糖替代MRS肉湯培養(yǎng)基中的碳源，在接種量為3%（V/V）、培養(yǎng)溫度為菌株最適溫度的條件下培養(yǎng)30 h；以活菌數(shù)和OD600nm值為考察指標，確定碳源，在篩選出最佳碳源基礎上，考察碳源添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）對菌株生長的影響。依次考察氮源種類（酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨和大豆蛋白胨）及氮源添加量（1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、生長因子（1 g/L吐溫-80、2 g/L低聚果糖、0.5 g/LL-抗壞血酸鈉、10 g/L番茄汁、8 g/L南瓜汁及其添加量（1 g/L、8 g/L、16 g/L、24 g/L、32 g/L）、初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對菌株生長狀況的影響。

1.3.4 高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對菌株生長影響顯著的4個因素進行4因素3水平的正交試驗優(yōu)化，以活菌數(shù)為評價指標，確定最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件[8]。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for culture conditions optimization

1.3.5 測定方法

活菌數(shù)的測定：參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行。

OD600nm值使用酶標儀進行測定；pH值直接用電子pH計進行測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析，以SPSS Statistics 21進行方差分析和LSD多重比較以及進行正交試驗方差分析，顯著水平P＜0.05；使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株LZ183E的生長曲線

圖1 菌株LZ183E在不同溫度下的生長曲線Fig.1 Growth curves of strain LZ183E at different temperatures

由圖1可知，隨著時間的延長，L.caseiLZ183E在不同溫度條件下均能維持較高活性。4～25 h基本進入對數(shù)生長期，此時菌株迅速生長，菌株生長速率顯著高于死亡速率，并且此時菌株活力高適合用于接種液[13]；25 h后進入穩(wěn)定期，雖然此階段菌株OD600nm值仍然上升，但相比4～25 h其生長速率顯著（P＜0.05）降低，且在30 h后OD600nm值增長速率降低，此時適合在培養(yǎng)液中收獲菌株；在45 h后個別溫度下菌株已經(jīng)開始進入衰退期，這可能是因為已經(jīng)死亡的菌株并未及時發(fā)生裂解，而導致OD600nm值表現(xiàn)出緩慢上升的現(xiàn)象。其中培養(yǎng)溫度為37 ℃時，整體OD600nm值較高，菌株表現(xiàn)出較好的生長活力，其延滯期較短（＜2.5 h）并且穩(wěn)定期時間維持較長，在48 h時并未出現(xiàn)衰退。因此，確定菌株最適培養(yǎng)溫度為37 ℃以及收獲時間為30 h。

2.2 菌株LZ183E培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 碳源種類及添加量對菌株LZ183E生長的影響

圖2 不同碳源對菌株LZ183E生長的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on strain LZ183E growth

由圖2可知，葡萄糖對LZ183E生長的促進作用顯著高于其他碳源（P≤0.05），其活菌數(shù)對數(shù)值和OD600nm值最高，分別為8.176±0.023和1.036±0.018?？赡艿脑蚴瞧咸烟呛凸堑葐翁悄軌虮籐AB直接代謝，而蔗糖、乳糖和麥芽糖等屬于雙糖，需要經(jīng)過LAB進一步分解才能被更好利用，從而影響了菌株的生長[15]。因此，選擇葡糖糖為最佳碳源。

圖3 葡萄糖添加量對菌株LZ183E生長的影響Fig.3 Effect of glucose addition on strain LZ183E growth

由圖3可知，隨著葡萄糖添加量的增加菌株的活菌數(shù)和OD600nm值，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。添加量為25 g/L時活菌數(shù)對數(shù)值和OD600nm值達到最大，分別為8.497±0.022和1.137±0.040；當添加量＜25 g/L之前，因缺乏菌株生長所需要的能源，LAB生長較差；＞25 g/L之后，葡萄糖含量偏高，導致培養(yǎng)環(huán)境滲透壓高，不利于菌株生長[16]。綜上可得，適合L.caseiLZ183E生長的最佳葡萄糖添加量為25 g/L。

2.2.2 氮源種類及添加量對菌株LZ183E生長的影響

圖4 不同氮源對菌株LZ183E生長的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on strain LZ183E growth

提供適宜的氮源對LAB的生長繁殖也極其重要，可以有效的降低高密度培養(yǎng)的成本[17]。由圖4可知，菌株LZ183E對不同氮源的利用存在顯著差異性（P＜0.05），其中酵母膏和大豆蛋白胨對LZ183E的增殖作用效果較好，活菌數(shù)較高，并且OD600nm值也高于1.0；然而無機氮源（如硫酸銨）表現(xiàn)出較差效果，活菌數(shù)對數(shù)值已經(jīng)低于7.0，難以滿足高密度培養(yǎng)技術的要求，表明復雜的有機氮比簡單的無機氮能夠提供更多、更有效的氮源，這一結果與黃寅[18]研究較為一致。由于酵母膏活菌數(shù)對數(shù)值（8.671±0.050）高于大豆蛋白胨（8.558±0.210），所以考慮酵母膏為最佳氮源。

圖5 酵母膏添加量對菌株LZ183E生長的影響Fig.5 Effect of yeast extract addition on strain LZ183E growth

由圖5可知，雖然隨著酵母膏添加量增加LAB的活菌數(shù)表現(xiàn)為先上升后下降，但不同用量的酵母膏對其活菌數(shù)和OD600nm值并無顯著影響（P＞0.05），表明菌株對酵母膏無濃度依懶性；而當酵母膏添加量為15 g/L時，活菌數(shù)對數(shù)值最高，為8.428±0.014。因此，選擇酵母膏為菌株LZ183E生長的最佳氮源，且添加量為15 g/L為宜。

2.2.3 生長因子種類及含量對菌株LZ183E生長的影響

圖6 不同生長因子對菌株LZ183E生長的影響Fig.6 Effect of different growth factors on strain LZ183E growth

生長因子通常指微生物自身難以合成，但又不可或缺，因此需要從外界環(huán)境中攝??；通常生長因子主要包括：維生素、嘌呤和嘧啶等[4]。由圖6可知，L.caseiLZ183E的活菌數(shù)對數(shù)值和OD600nm值分別在7.747～8.735、0.871～1.003之間，其中南瓜汁對菌株LZ183E的活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05），相對其它生長因子含南瓜汁的培養(yǎng)基活菌數(shù)對數(shù)值最高，為8.735±0.069；然而OD600nm值比吐溫-80小0.102，這可能是因為吐溫-80作為一種表面活性劑能減緩已死亡菌體的裂解，使得OD600nm值偏高，但其對LZ183E的生長增殖效果不如南瓜汁。此外，由于南瓜汁屬于天然物質(zhì)，成分組成較為復雜，其不僅能提供微生物生長所需的生長因子，而且能夠適當滿足菌株生長的其他營養(yǎng)物質(zhì)，因此選擇南瓜汁為最佳生長因子。

圖7 南瓜汁添加量對菌株LZ183E生長的影響Fig.7 Effect of pumpkin juice addition on strain LZ183E growth

由圖7可知，不同用量的南瓜汁對菌株LZ183E的活菌數(shù)影響較為顯著（P＜0.05），呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；而對OD600nm值的影響較小。在南瓜汁添加量為24 g/L時，最高活菌數(shù)對數(shù)值為8.753±0.159，此時OD600nm值為1.011±0.072。綜合可知，L.caseiLZ183E的最佳生長因子為南瓜汁，添加量為24 g/L。

2.2.4 初始pH值對菌株LZ183E生長的影響

圖8 初始pH值對菌株LZ183E生長的影響Fig.8 Effect of initial pH value on strain LZ183E growth

由圖8可知，培養(yǎng)基的初始pH對LAB的生長影響不顯著（P＞0.05），但活菌數(shù)對數(shù)值和OD600nm值呈先上升后下降的趨勢，初始pH值為6.5時有最大值，分別為8.229±0.078和0.979±0.007。雖然此范圍pH值并不能明顯影響菌株的生長，但環(huán)境pH是影響菌株生長的重要因素，pH值過低或過高均會抑制LAB的生長，并且低pH值條件先細胞容易發(fā)生自溶，這也就解釋了初始pH低于6.0時，活菌數(shù)差異不明顯而OD600nm值明顯降低[18]。因此，選擇初始pH值為6.5時最佳。

2.2.5 接種量對菌株LZ183E生長的影響

圖9 接種量對菌株LZ183E生長的影響Fig.9 Effect of inoculum on strain LZ183E growth

由圖9可知，菌株LZ183E的活菌隨著接種量的增加逐漸增加，當接種量為2%時活菌數(shù)顯著高于其他接種量，此時活菌數(shù)對數(shù)值最高為8.386±0.042，隨后逐漸下降；在接種量為5%時活菌對數(shù)值已經(jīng)降至7.5，不再滿足高密度培養(yǎng)要求?？赡苁且驗榻臃N量較低初始菌株數(shù)較少，其延滯期延長；而接種量過高導致原有菌液改變了菌株培養(yǎng)基的初始環(huán)境，延緩了菌株的早期的生長。然而接種量為2%時，其OD600nm值最低（0.729±0.147），原因可能是菌株生長較快使得培養(yǎng)體系pH值下降也較快，低酸環(huán)境中死亡的菌體更容易發(fā)生裂解所致，這表明OD600nm值并不一定能準確反應培養(yǎng)體系中菌株的活性。綜上可知，菌株LZ183E的最佳接種量為2%。

2.3 菌株LZ183E培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal experiment tests

由表2和表3可知，在給定的水平區(qū)間，對L.caseiLZ183E生長繁殖的影響因素主次為A（葡萄糖）＞C（南瓜汁）＞D（接種量）＞B（酵母膏）；其中酵母膏用量對干酪乳桿菌的生長影響差異無顯著影響（P＞0.05），而葡萄糖、南瓜汁和接種量對菌株的生長為極顯著（P＜0.01），其中碳源是影響干酪乳桿菌的生長的主要因素，含適宜碳源的培養(yǎng)成分更有利于L.caseiLZ183E的生長，這一結果同樣出現(xiàn)在熊素玉等研究結果中[19-21]；根據(jù)正交試驗結果，L.caseiLZ183E優(yōu)化條件為A2B3C2D2，即葡萄糖25 g/L、酵母膏20 g/L、南瓜汁24 g/L和接種量2%。在此優(yōu)化條件下，L.caseiLZ183E活菌數(shù)對數(shù)值為9.204±0.036。

3 結論

根據(jù)生長曲線、單因素試驗和正交試驗結果，L.caseiLZ183E的高密度培養(yǎng)的最佳條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、碳源為葡萄糖（25 g/L）、氮源為酵母膏（20 g/L）、生長因子為南瓜汁（24 g/L）、初始pH值6.5以及接種量2%。并且在此條件下進行驗證，活菌數(shù)對數(shù)值可達9.204±0.036，OD600nm值為1.136，比原始MRS培養(yǎng)基（8.121±0.056）高出一個數(shù)量級，為下一步利用真空冷凍干燥技術制備直投式發(fā)酵劑奠定了試驗基礎。