吳雋松，滕飛翔，楊留才

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇鹽城 224005）

發(fā)酵乳是以乳或乳制品為主要原料，通過接種乳酸菌發(fā)酵而成[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)外，還可通過微生物作用將原料中不易吸收的大分子成分轉(zhuǎn)化為易于吸收的小分子物質(zhì)，同時產(chǎn)生大量的乳酸、其他有機酸、B族維生素、氨基酸、酶類等[2-5]，研究證實，發(fā)酵乳有改善腸道菌群、預(yù)防腸道疾病、預(yù)防心血管疾病、抗衰老以及抗腫瘤等功效[6-8]。隨著生活水平的提高，人們對發(fā)酵乳的口味、香氣、質(zhì)地、營養(yǎng)和功能的要求越來越多元化[9]，如草莓發(fā)酵乳、燕麥芒果發(fā)酵乳、藏靈菇發(fā)酵乳、黑豆番茄發(fā)酵乳、含醇發(fā)酵乳等[10-13]，深受人們喜愛。

白首烏（Cynanchum bungei）作為中國傳統(tǒng)中藥，味甘、苦，性微溫，具有補肝腎、益精血、強筋骨、烏須發(fā)、延年益壽等作用[14-16]。研究表明，白首烏含有粗多糖、粗蛋白、粗脂肪、維生素、氨基酸以及鈣、鐵、鋅、鎂等人體必需的礦物質(zhì)元素，其含有的多羥基孕甾烷苷酯類化合物和苯乙酮類化合物，已被證實具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化和降血脂等功效[17-20]。目前，由白首烏加工得到的食品多為初加工，如制成白首烏粉、白首烏片、白首烏脯等形式，但存在即食性差、營養(yǎng)損失嚴重，造成資源的浪費和環(huán)境污染等問題[21]。利用微生物發(fā)酵作用制備白首烏酵素成為研究熱點，李凡等[22]以純白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì)，乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵制成一種含有大量活菌的白首烏酵素。但是市面上關(guān)于白首烏發(fā)酵乳制備及其抗氧化性研究較少。因此，本研究以江蘇鹽城市濱海白首烏粉和奶粉為原料，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，利用雙響應(yīng)值優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳飲料制備工藝，得到一款風(fēng)味獨特、抗氧化性能較高的白首烏發(fā)酵乳，從而為白首烏資源開發(fā)和白首烏產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

白首烏、牛乳、蔗糖（食品級）：市售；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbruechiisubsp.bulgaricus），CGMCC 1.2161、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），CGMCC 1.1855：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒[2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）法]：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1-M81磨粉機：九陽股份有限公司；YP2001B電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；PYX02電熱恒溫培養(yǎng)箱：FD-2D-80真空冷凍干燥機：上海繼譜電子科技有限公司；佰輝電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：上海篤特科學(xué)儀器有限公司；UV752紫外分光光度計：山東博科科學(xué)儀器有限公司；PHS-25酸度計：上海越平科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24N垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：上海賽百奧科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白首烏發(fā)酵乳制備工藝及操作要點

白首烏預(yù)處理→破碎過篩→加入奶粉及蔗糖→均質(zhì)→滅菌→接種→發(fā)酵→后熟→無菌灌裝→成品

操作要點：白首烏清洗后，切成厚0.5 cm左右的片狀，真空冷凍干燥12 h后破碎磨粉，過60～80目篩后按一定比例加入奶粉和蔗糖后于5 MPa、50～60 ℃條件下均質(zhì)，然后120～130 ℃條件下瞬時滅菌后，降至25～28 ℃，按1∶1比例接種德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌，在1%～5%接種量、28～32 ℃溫度一定條件下發(fā)酵6～30 h，然后在4 ℃冰箱中后熟12～24 h，最后無菌灌裝，得到一款營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特的白首烏發(fā)酵乳。

1.3.2 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化單因素試驗

為使產(chǎn)品風(fēng)味獨特、口感更為柔和，對其過篩目數(shù)、白首烏粉、奶粉和蔗糖的添加比例、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行優(yōu)化，以感官品評作為評價指標。選定白首烏粉過篩目數(shù)為50、60、70、80、90目，白首烏、奶粉和蔗糖的添加質(zhì)量比為1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、2∶1∶1、1∶2∶2，菌種接種量為1%、2%、3%、4%、5%，發(fā)酵溫度分別為28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃，發(fā)酵時間分別為6 h、12 h、18 h、24 h、30 h，研究這幾個因素對白首烏發(fā)酵乳感官評分影響。

1.3.3 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

選取單因素試驗中對響應(yīng)值（感官評分）有顯著影響的因素，菌種接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C），設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 白首烏發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of Cynanchum bungei fermented milk

1.3.4 測定方法

感官評定：由50名評審員（具有食品感官品評經(jīng)驗的學(xué)生）從色澤、滋味與香味、口感、組織狀態(tài)等方面進行評分，感官評定標準如表2所示。

表2 白首烏發(fā)酵乳感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of Cynanchum bungei fermented milk

ABTS法抗氧化活性測定：依據(jù)參考文獻[23]的操作方法，繪制的得到標準曲線回歸方程為y=5.152 4x-3.680 1，相關(guān)系數(shù)R2為0.996。然后以同樣的方法測定白首烏發(fā)酵乳維生素C含量，ABTS值以維生素C當量（vitamin C equivalent，VCE）表示。

活菌數(shù)的測定：依據(jù)參考文獻[24]的操作方法，計算白首烏發(fā)酵乳中的活菌數(shù)。

酸度測定：依據(jù)參考文獻[25]的操作方法，記錄白首烏發(fā)酵乳消耗標準氫氧化鈉溶液體積，計算白首烏發(fā)酵乳酸度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 過篩目數(shù)對白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

由圖1可知，在50～90目范圍內(nèi)，隨著過篩目數(shù)的增大，感官評分呈先增高后降低趨勢，在80目時達到最高，此時感官評分達到88分，增高的原因可能是由于目數(shù)增加，白首烏粉粒度越來越小，口感及組織狀態(tài)更為細膩、柔和，從而感官評分上升，當粉碎過細時，易于粘結(jié)成塊，不利于微生物作用，從而使得發(fā)酵不完全導(dǎo)致感官評分下降；與此同時，在50～80目范圍內(nèi)，ABTS值隨目數(shù)增加呈先增高后降低趨勢，在80目時達到最高值，為575.45 mgVCE/L，表明隨著白首烏粒度越小，原料利用率越高，活性成分形成越多，但當粒度過細時易于粘結(jié)成塊，不利于微生物作用，從而使得發(fā)酵不完全導(dǎo)致抗氧化性能下降。因此，選擇過篩篩目為80用于后續(xù)試驗。

圖1 過篩目數(shù)對白首烏發(fā)酵乳感官評分和抗氧化能力影響Fig.1 Effect of meshes on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

2.1.2 白首烏粉、奶粉和蔗糖添加質(zhì)量比對白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖2 添加原料質(zhì)量比對白首烏發(fā)酵乳感官評分和抗氧化能力影響Fig.2 Effect of addition mass ratio of material on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖2可知，隨白首烏粉、奶粉和蔗糖添加比例的變化，白首烏發(fā)酵乳的感官評分呈先降低后升高再降低的趨勢，當白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2時感官評分達到最高，為90分，此時白首烏發(fā)酵乳奶香突出，有淡淡藥香，且酸甜可口，原因是此時奶粉、蔗糖、白首烏粉發(fā)酵生成的糖酸比合適，且白首烏香氣不突出；當白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=2∶1∶1時，白首烏發(fā)酵乳ABTS值最高，為581.32 mgVCE/L，其次為1∶2∶2，ABTS值為573.2 mgVCE/L，但此時白首烏粉比例為最低，原因可能是由于奶粉、蔗糖比例較高，微生物發(fā)酵作用較好，導(dǎo)致的白首烏中抗氧化成分溶于發(fā)酵乳以及微生物作用生成較多抗氧化物質(zhì)所致。因此，綜合考慮感官評分和ABTS值，選擇白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2添加比例用于后續(xù)試驗。

2.1.3 接種量對白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖3 接種量對白首烏發(fā)酵乳感官評分和抗氧化能力影響Fig.3 Effect of inoculum on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖3可知，在接種量1%～4%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，感官評分逐漸增加，當接種量為4%時達到最高，最高為86分，此時白首烏發(fā)酵乳酸度較為適中，酸甜比較為合適，當接種量＞4%時，酸度過高，導(dǎo)致感官評分下降；接種量對白首烏發(fā)酵乳抗氧化活性也有一定影響，ABTS值在接種量為1%～3%范圍內(nèi)逐漸增高，3%達到最高，為554.4 mgVCE/L，隨后趨于平緩，表明接種量增加在1%～3%范圍內(nèi)可以加快發(fā)酵過程中抗氧化活性物質(zhì)的形成。由于接種量的增加，微生物對原料的利用率增加，白首烏粉中抗氧化物質(zhì)（如多酚黃酮等）成分會隨著微生物的作用從其細胞壁中釋放到發(fā)酵體系中，從而引起抗氧化活性增高。但是，如果接種量過多，微生物生長也會消耗更多的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也會導(dǎo)致部分抗氧化物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解，使得抗氧化活性降低。因此，選擇最適接種量為4%用于后續(xù)試驗。

2.1.4 發(fā)酵溫度對白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖4 發(fā)酵溫度對白首烏發(fā)酵乳感官評分和抗氧化能力影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖4可知，在28～32 ℃范圍內(nèi)，感官評分隨著發(fā)酵溫度的升高呈先增加后降低趨勢，發(fā)酵溫度為31 ℃時，感官評分達到最高為83分，溫度過低或過高，會造成微生物較少或者較多，菌種活性較差，同時發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸過低或過高，從而使得感官評分較低；ABTS值隨發(fā)酵溫度變化趨勢與感官評分變化趨勢與一致，發(fā)酵溫度為31 ℃時，ABTS值達到最高為562.3 mgVCE/L，可能是由于適宜的溫度使得白首烏發(fā)酵乳菌的數(shù)量和活性較為適中，從而通過微生物作用，使得白首烏發(fā)酵乳抗氧化活性較高。因此，選擇發(fā)酵溫度為31 ℃用于后續(xù)試驗。

2.1.5 發(fā)酵時間對白首烏發(fā)酵乳感官及抗氧化能力的影響

圖5 發(fā)酵時間對白首烏發(fā)酵乳感官評分和抗氧化能力影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由圖5可知，在6～24 h范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分呈先增加后降低趨勢，當發(fā)酵時間為24 h時，感官評分達到最高，為86分，隨后降低，表明隨著發(fā)酵時間的延長，菌的數(shù)量逐漸增加，乳酸等有機酸逐漸增加，在24 h達到較優(yōu)的甜酸比，隨后，酸度繼續(xù)增加，引起過酸的不適感，導(dǎo)致感官評分降低；在6～18 h范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時間，ABTS值逐漸增加，發(fā)酵時間為18 h時，達到最高為583.6 mgVCE/L，隨后呈降低趨勢，可能是由于發(fā)酵時間過長會引起白首烏發(fā)酵乳中活性成分的分解。同時發(fā)酵時間的延長會引起生產(chǎn)周期長、成本高等，因此，選定發(fā)酵時間為18 h。

2.2 雙響應(yīng)值聯(lián)合優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳工藝

采用Design Expert 10軟件設(shè)計Box-Behnken試驗，在過篩數(shù)目為80目，白首烏粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2條件下，以白首烏發(fā)酵乳感官評分（R）為響應(yīng)值，優(yōu)化接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）及發(fā)酵時間（C），獲得白首烏發(fā)酵乳最佳發(fā)酵條件。Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

響應(yīng)值（感官評分）所得的回歸方程為：

回歸方程方差分析見表4。由表4可知，所設(shè)定的各發(fā)酵因素對感官評分影響順序為A＞B＞C，即接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間，三者對于感官評分影響顯著（P＜0.05），交互項BC以及二次項A2、B2、C2對感官評分的影響顯著（P＜0.05），交互項AC對感官評分影響極顯著（P＜0.01）；感官評分回歸模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項P值不顯著，表明回歸方程擬合度較好，在自變量范圍內(nèi)能較好的反映響應(yīng)值變化，可用于白首烏發(fā)酵乳優(yōu)化工藝參數(shù)的理論值預(yù)測。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

發(fā)酵條件交互作用對感官評分影響的立體分析圖分別如圖6。由圖6可知，接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度這三個因素交互作用在感官評分響應(yīng)面立體圖上均存在極值，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的側(cè)剖面圖弧度大于接種量的側(cè)剖面弧度，表明發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對感官評分模型的影響大于接種量的影響，從響應(yīng)面立體圖的投影，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的等高線圖更接近橢圓，表明二者交互作用較顯著。

預(yù)測白首烏發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量4.86%、發(fā)酵溫度為30.25 ℃、發(fā)酵時間為10.8 h。在此條件下，感官評分理論值為90分、ABTS理論值為585.7 mgVCE/L。為操作方便，對預(yù)測最優(yōu)值進行調(diào)整，選定接種量5%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為11 h作為最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。然后進行驗證試驗，結(jié)果顯示，在此條件下感官評分實際值為88分、ABTS實際值580.2mgVCE/L，實測值與預(yù)測值無顯著性差異。

圖6 接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間交互作用對白首烏發(fā)酵乳感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on sensory score of Cynanchum bungei fermented milk

2.3 白首烏發(fā)酵乳活菌數(shù)與酸度測定

測定優(yōu)化后工藝制備的白首烏發(fā)酵乳中的活菌數(shù)和酸度，結(jié)果顯示，白首烏發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)為2.2×108個/mL≥1×106個/mL，大腸桿菌數(shù)≤1 CFU/mL；致病菌未檢出，其酸度測定值為85°T≥70°T，均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》。

3 結(jié)論

以白首烏粉、奶粉和蔗糖為原料，德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏發(fā)酵乳工藝參數(shù)，最終得到：在過篩目數(shù)70目、白首烏粉∶奶粉∶蔗糖添加質(zhì)量比為1∶2∶2、接種量為4%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為11 h條件下，感官評分和ABTS值最高，分別為88分和580.2 mgVCE/L，此時活菌數(shù)2.2×108個/mL，酸度為85°T，即得到一款口感柔和、風(fēng)味獨特、滋味鮮美、抗氧化活性高的白首烏發(fā)酵乳。