莫禮艷，唐明華

（玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 玉林 537000）

安賽蜜是一種人工合成甜味劑，化學(xué)名稱為乙?；前匪徕洠?］，又稱AK 糖，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，若超量使用，則可能引起不同程度的中毒表現(xiàn)［2］，因此必須對(duì)其使用量進(jìn)行嚴(yán)格管理。GB2760 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［3］對(duì)安賽蜜在糕點(diǎn)中的應(yīng)用范圍有明確的規(guī)定。因此對(duì)糕點(diǎn)中安賽蜜的監(jiān)管不僅關(guān)系到產(chǎn)品的品質(zhì)，更關(guān)系消費(fèi)者的安全與健康［2］。在實(shí)際檢測中，當(dāng)安賽蜜的檢出值在限量值附近時(shí)，實(shí)驗(yàn)室出具的檢測結(jié)果直接關(guān)系到樣品是否合格的判定［4］。因此，為確保結(jié)果的可信度，必須進(jìn)行不確定度的評(píng)估。本研究對(duì)SN/T 3538—2013［5］糕點(diǎn)中安賽蜜的檢測方法進(jìn)行了不確定度評(píng)定，識(shí)別試驗(yàn)過程中不確定度的來源，量化各分量的不確定度，分析各分量的不確定度對(duì)檢測結(jié)果的影響，以期優(yōu)化檢測過程，減少檢測誤差，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［6］，為UPLC-MS/MS 法測定糕點(diǎn)中安賽蜜不確定度的評(píng)定提供參考依據(jù)［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；BSA822-CM 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ROATNTA 460R 型離心機(jī)，德國SIGMA 公司；541-10000-00-1 型渦旋混勻器，德國海道夫公司。

1.1.2 試劑 安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品，DR. 公司，批號(hào)為G129941，含量以99.18% 計(jì)，擴(kuò)展不確定度U=0.56%；甲醇，默克股份兩合公司，色譜純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

1）標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（1 mg/mL）的制備。精密稱取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品約25 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。

2）標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 μg/mL）的制備。精密吸取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（約1 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。

3）系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備。分別精密吸取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（約1 μg/mL）0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，搖勻，即得。濃度分別為2、5、10、20、50、100 ng/mL。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取2.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 塑料管中，加入20 mL 甲醇∶水（1∶1）溶液，超 聲提 取20 min，4 600 r/min 離 心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中。重復(fù)提取1 次，合并上清液，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至50 mL。過0.45 μm 有機(jī)濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定［5］。

1.2.3 儀器條件

1）色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相為0.1% 甲酸-5 mmol/L 甲酸銨溶液-乙腈（10∶90）；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子（ESI）源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；RF 透鏡電壓0.5 V；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；采集模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）。監(jiān)測離子參數(shù)見表1。

表1 安賽蜜離子對(duì)信息

1.2.4 不確定度分量的來源分析

2）不確定度分量。根據(jù)數(shù)學(xué)模型及測量過程，測定結(jié)果的不確定度分量主要來自標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備、系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、樣品（前處理、回收率和測量重復(fù)性）和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備過程引入的不確定度urel（m）

2.1.1 由電子天平稱量引入的不確定度u1，r（elm） 天平檢定證書給出的示值允許誤差±0.05 mg，服從均勻分布，k =，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u1(m) =

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度引入的不確定度u2，r（elm） 證書給出的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U=0.56%，純度為99.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10-3。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液定容引入的不確定度u3，rel（m） JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，25 mL A 級(jí)量瓶容量的允許誤差為±0.03 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為10-2mL。試驗(yàn)環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)入 的 相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 為 u3,rel(m) =

2.1.4 由標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程引入的相對(duì)不確定度urel（v）

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程的不確定度主要由移液槍移取的體積、玻璃量器定容的體積、實(shí)驗(yàn)室的溫度等引起。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度u1，rel（v） 精密吸取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（1.0 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，配制后濃度約為1.0 μg/mL。 按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［9］100 μL 移液器吸取100 μL溶液允許誤差為±2.0%，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為驗(yàn)環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生的不確定度 為

吸液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u1-1,rel(v)=

JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，100 mL A 級(jí)量瓶容量的允許誤差為±0.10 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：u1-3(v) =

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制引入的不確定度u2，rel

（v） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)所使用移液器的量程有0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL。 按JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［9］規(guī)定，容量允許誤差分別為±4.0%、±3.0%、±2.0%、±1.5%、±0.6%、±0.6%，則由體積校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

試驗(yàn)環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：

JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，10 mL A 級(jí)量瓶容量的允許誤差為±0.020 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：u2-3(v) =

試驗(yàn)環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生

2.2.3 由標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（v）為：

2.3 樣品引入的相對(duì)不確定度u1，rel（r）

2.3.1 樣品前處理引入的相對(duì)不確定度ure（lr） 50 mL A 級(jí)單標(biāo)線吸量管容量允許誤差為±0.05，按三角形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.04 × 10-2。 試 驗(yàn) 環(huán) 境 溫 度 為（20±5）℃，甲 醇 在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，則由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u1-2(r) =0.172 mL。由以上2 項(xiàng)引入的合成樣品定容引入的相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ： u1,rel(r) =

2.3.2 樣品重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度u2，rel（r）取陽性樣品8 份進(jìn)行測定，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均值為0.940 9 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%。測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10-3。則測量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：重 復(fù) 性 結(jié) 果 見表2。

2.3.3 回收率引入的相對(duì)不確定度u3，rel（r） 試驗(yàn)設(shè)置高、中、低3 個(gè)濃度水平，各濃度水平分別準(zhǔn)確稱取空白樣品2.0 g，分別精密加入“1.2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品中間液0.4、1.0、2.0 mL ，按照供試品溶液的制備加標(biāo)回收樣品溶液，每個(gè)平行制備2 份，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），平均回收率為96.42%，RSD 為1.2%?；厥章蕵?biāo)準(zhǔn)不確定度為入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為5.08 × 10-3。加標(biāo)回收結(jié)果見表3。

表2 重復(fù)性結(jié)果

表3 加標(biāo)回收結(jié)果

2.3.4 樣品引入的相對(duì)不確定度 綜合以上3 個(gè)分量的不確定度，樣品引入的相對(duì)不確定度為：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合與測量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度urel（c）

安賽蜜的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)為：Y=262.631X-16.404 7，r=0.999 7，標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表4，平均值為32.018 ng/mL。根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》［10］，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度由下式計(jì)算：

SR=，式中，SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差標(biāo)準(zhǔn)差；B 為斜率；C 為待測樣品平均質(zhì)量濃度；n 為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)；p 為待測樣品重復(fù)測定次數(shù)；C0為回歸曲線各點(diǎn)質(zhì)量濃度的平均值；C0j為回歸曲線各點(diǎn)質(zhì)量濃度；Yj為各標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際響應(yīng)值；Y理論值為回歸曲線所測理論值。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

3 擴(kuò)展不確定度U

3.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

3.2 相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel

取 置 信 概 率P=95%，k=2，Urel= 0.206 × 2 =0.412。

3.3 擴(kuò)展不確定度U

U = 0.940 9 × 0.412 = 0.39 (mg/kg)

4 討論

通過分析和評(píng)估不確定度來源發(fā)現(xiàn)，對(duì)于結(jié)果不確定度影響為：系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制＞標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合＞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備＞樣品（前處理、回收率和測量重復(fù)性），標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制過程是不確定度的最主要來源［11］。因此，可以通過改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，采用高精度的移液器和容量瓶，提升儀器設(shè)備的穩(wěn)定性等措施來修正［12］。該試驗(yàn)根據(jù)CNASGL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》［10］分析UPLC-MS/MS 法測定糕點(diǎn)中安賽蜜的不確定度來源，建立科學(xué)的數(shù)學(xué)模型并量化各個(gè)影響分量，得出安賽蜜測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為0.39 mg/kg（k=2）。當(dāng)測量結(jié)果接近限量值時(shí)，為檢品判定提供依據(jù)，同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室日常質(zhì)量控制提供參考［7］。