邢瀟　徐彤彤　梁玉冰　閆艷　李巖　劉治民

摘 要：通過(guò)對(duì)啤酒花中的槲皮素及山柰素的酸水解HPLC含量測(cè)定方法研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。采用不同提取方法（溶劑、HCl濃度、HCl比例等）對(duì)其進(jìn)行樣品提取方法考察，確定色譜條件，并進(jìn)行方法學(xué)考察研究。結(jié)果表明：該方法靈敏、精密度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于啤酒花中槲皮素及山柰素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：啤酒花;槲皮素;山柰素

中圖分類號(hào)：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20201130007

啤酒花為?？浦参锲【苹ǎ℉umulus lupulus L.）的干燥雌花序，別名蛇麻草、唐草花、忽布、酵母花等，主產(chǎn)于東北、華北、山東、新疆等地。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為啤酒花有健胃消食、安神利尿、抗癆消炎等作用，對(duì)消化不良、腹脹、肺結(jié)核、膀胱炎、咳嗽、失眠、麻風(fēng)等疾病均有療效[1-3]。現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物是啤酒花中的重要活性成分，是控制啤酒花藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。但大多數(shù)黃酮類化合物在口服后，會(huì)經(jīng)過(guò)酶的水解轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的黃酮苷元被吸收，因此黃酮苷元的含量可以作為黃酮類物質(zhì)有效成分的評(píng)估[4]。近年來(lái)研究表明，槲皮素可顯著改善肺結(jié)核小鼠炎癥反應(yīng)，而啤酒花的一個(gè)重要功效就是治療肺結(jié)核，這可能就與其含有此類抗氧化物質(zhì)有關(guān)[5]。本研究選用啤酒花中水解黃酮苷元中的槲皮素、山柰素為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，對(duì)啤酒花的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 儀器與試劑試藥

Agilent 1260型號(hào)高效液相色譜儀;天津泰斯特儀器有限公司DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋;日本A＼＼D公司GR-202電子天平。

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201610）及山柰素對(duì)照品（批號(hào)：110861-201611）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;色譜甲醇（Merck）;乙醇（天津市鑫鉑特化工有限公司）等。在市場(chǎng)上購(gòu)買12批啤酒花樣品，經(jīng)長(zhǎng)春市食品藥品檢驗(yàn)中心教授鑒定為?？浦参锲【苹ǖ母稍锎苹ㄐ颉?/p>

2 方法考察與結(jié)果

2.1 色譜條件

經(jīng)DAD光譜在200～400nm進(jìn)行掃描，考慮其基線平穩(wěn)程度及最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)合文獻(xiàn)查詢，最終槲皮素及山柰素的測(cè)定波長(zhǎng)為360nm。

采用Agilent5 TC-C18（2） （4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，分別以不同流動(dòng)相（乙腈-0.4%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-水）比例、不同柱溫、不同流速下進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，甲醇-0.4%磷酸（48∶52）可以將槲皮素、山柰素成分進(jìn)行有效分離，且不受柱溫及流速的影響。

2.2 提取方法

由于槲皮素、山柰素為黃酮類化合物酸水解后的產(chǎn)物，因此提取溶劑中考慮加入HCl對(duì)其進(jìn)行水解。

取樣品粉末約0.2g，加入不同溶劑與酸混合的混合溶液，置水浴中加熱回流，按上述色譜條件進(jìn)行樣品提取溶劑（甲醇、80%甲醇、乙醇）、HCl濃度（50%、75%、100%）、甲醇-HCl比例（35∶15、40∶10、45∶5）、提取方式（超聲、回流）及水解溫度（75℃、80℃、85℃、90℃、100℃）的考察，以槲皮素和山柰素含量之和作為考察結(jié)果。結(jié)果表明，樣品以甲醇-HCl（4∶1）溶液50mL做溶劑，置80℃水浴中加熱回流30min，提取最為完全，分離效果好，見(jiàn)圖1～3。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系考察

將槲皮素及山柰素對(duì)照品加甲醇制成含槲皮素9.940μg·mL-1、山柰素3.976μg·mL-1的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸1μL、5μL、8μL、10μL、15μL、20μL，注入液相色譜儀，繪制對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在0.0099～0.1988μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=62753X+45.02，相關(guān)系數(shù)r=0.9999;山柰素進(jìn)樣量在0.0040～0.0795μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=15688X+45.02，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.3.2 中間精密度

取同一批次啤酒花藥材，按上述方法，在不同時(shí)間，由本實(shí)驗(yàn)室3名分析人員分別制備供試品溶液，分別用3臺(tái)高效液相色譜儀，測(cè)定槲皮素與山柰素的含量并計(jì)算和，結(jié)果其平均含量為0.133%、n=3、RSD=0.6%，說(shuō)明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 準(zhǔn)確度

取重復(fù)性試驗(yàn)同批次樣品（槲皮素含量：0.0995%;山柰素含量：0.0350%）9份，每份取約0.2g，精密稱定，再分別加入50%、100%、150%槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品適量，按上述色譜方法進(jìn)樣，測(cè)定其中槲皮素、山柰素的含量，分別計(jì)算回收率。結(jié)果槲皮素平均回收率分別為99.9%、n=9、RSD=2.4%;山柰素平均回收率分別為88.4%、n=9、RSD=2.9%，說(shuō)明本方法回收率良好。

2.3.4 耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在在不同儀器（Agilent 1260、HP1100、島津2010），采用不同品牌色譜柱：Agilent5 TC-C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）、Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）、TnatureC18（4.6mm×250mm，5μm），依上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示供試品色譜中的槲皮素和山柰素色譜峰均能得到良好的分離效果，表明本方法耐用性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液10μL，分別在0h、3h、6h、9h、12h、24h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果槲皮素與山柰素的平均峰面積和為4645.2、n=6、RSD=0.8%。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測(cè)定

依上述方法測(cè)定12批樣品，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

文獻(xiàn)表明，只用超聲法或回流法對(duì)藥材中的槲皮素和山柰素進(jìn)行提取，其測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，無(wú)法真實(shí)表達(dá)樣品中的黃酮類成分含量，因此本研究采用酸水解法進(jìn)行啤酒花中槲皮素及山柰素的含量測(cè)定。方法學(xué)研究結(jié)果顯示，該方法靈敏、精密度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，且符合黃酮類化合物的實(shí)際代謝情況，可作為該品種的內(nèi)在質(zhì)量控制方法。結(jié)果顯示，啤酒花樣品中槲皮素與山柰素含量和在0.072%～0.175%差異較大，可能與產(chǎn)地、加工、生產(chǎn)、貯存等因素有關(guān)。希望本研究方法及樣品實(shí)測(cè)結(jié)果可以在啤酒花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中作為參考及依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯 李媛媛）

收稿日期：2020-10-27

基金項(xiàng)目：吉林省中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目“中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)-啤酒花”（項(xiàng)目編號(hào)：2017-3）

作者簡(jiǎn)介：邢瀟（1983-），女，博士，副主任藥師。研究方向：中藥材及飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);通訊作者劉治民（1982-），男，碩士，主管藥師。研究方向：中藥材檢驗(yàn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)。