陳森怡，劉振民，焦晶凱，龐佳坤，余 意

（1.乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

乳酸菌是革蘭氏陽性、非孢子型細菌，可以將碳水化合物發(fā)酵成乳酸。乳酸菌是屬于基因多樣性的細菌，包括桿狀細菌：如乳酸桿菌；球菌：如鏈球菌、乳球菌、腸球菌、小球菌或明串珠菌等[1]。乳酸菌已在食品發(fā)酵方面使用多年，如干酪、酸奶等乳制品。乳酸菌在干酪的制作中占有極其重要的角色，諸如水解乳糖快速產酸、蛋白水解和脂肪分解極大地促進了風味及質地的發(fā)展[2-3]。

干酪的結構性質通常用質構以及流變學性質表觀。干酪質地受決定結構因素的影響，如牛乳成分、水分含量、pH值和蛋白水解程度等[4]。流變學是壓縮、剪切等過程中應力或者應變的響應[5]。目前有很多關于奶酪結構影響因素的研究，如蛋白質脂肪的含量[6]、凝乳酶類型[7]、凝乳的方式[8]、貯存方式[9]等。

新鮮干酪是指生牛乳、稀奶油、乳清粉或者其混合物經過添加干酪發(fā)酵劑、凝乳酶而形成凝塊的產品，它未經成熟或者成熟期極短，由于其質地柔軟、口味清淡爽口、含水量較高，易被我國消費者所接受，因此在國內日益受歡迎[10]。但目前很多特色的干酪依舊不為國人所接受，因此考慮從中國盛產干酪的地區(qū)開發(fā)出一些的特色菌株用于干酪生產，由此改善干酪的質量以及安全性。

本研究從新疆、云南、西藏等地采取的干酪樣品中分離出的多株乳酸菌中，選取7 株具有代表性特色菌株進行發(fā)酵性能的評估，并應用于新鮮干酪中，從質構和動態(tài)流變學上進行分析，篩選出適合新鮮干酪制作的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪制作中的生牛乳原料取自光明乳業(yè)股份有限公司；篩選菌株來自光明乳業(yè)股份有限公司：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）E11、C44，瑞士乳桿菌（L. helveticus）G12，干酪乳桿菌（L. casei）D41，副干酪乳桿菌（L. paracasei）B1，腸球菌（Enterococcus faecium）F22、N，從新疆、西藏、云南奶酪中分離獲??；CHOOZITTMMA14菌株 丹麥科漢森公司；凝乳酶Marzyme 中國Danisco公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；L-亮氨酸對硝基苯胺、對硝基苯胺、Tris-HCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；奶酪槽 英國Armfiled公司；高壓均質機 丹麥APV公司；三合一pH計 德國賽多利斯公司；BROOKFILED-DVII＋黏度計 美國博勒飛公司；Mb45水分測量儀 美國Ohous公司；SCIENTZ-IID細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；5417R離心機 德國Ependorf公司；SPECORD紫外-可見分光光度計 德國Analytik Jena AG公司；ARES-G2流變儀美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取少量凍存管的菌種接種于5 mL新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中，放于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體沉淀，有沉淀產生后，按2%～3%接種量接種于新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中活化第2代，依次活化2～3 代。

1.3.2 產酸性能測定

將活化好的7 株菌均以3%接種量分別接種在無菌脫脂乳中，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵乳pH值，計算ΔpH值，即ΔpH值為發(fā)酵0～24 h之間的變化值。

1.3.3 產黏能力的測定

將7 株菌株分別以3%的接種量接種在100 mL 12 g/100 mL的無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至全部凝乳，記錄凝乳時間并測定各組發(fā)酵乳黏度，黏度測定參數設置：選擇轉子LV 2，轉速64 r/min，測量時間1 min。每隔10 s測定1 次，測定3 次并計算黏度平均值。

1.3.4 自溶度的測定

參考Al-Saleh等[11]的方法進行部分修改，分別將7 株菌進行活化傳代，按3%的比例接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數期；將菌體4 ℃、9 000 r/min冷凍離心15 min，取離心獲得的菌體（沉淀）重懸浮于50 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，洗滌2～3 次，使菌液在波長650 nm處的吸光度在0.7～0.8之間。將菌體懸浮液置于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在650 nm波長處測定24 h前后吸光度的變化。用磷酸鹽緩沖液作為空白對照。菌株自溶度按式（1）計算：

式中：At為菌懸液24 h后吸光度；A0為菌懸液初始吸光度。

1.3.5 氨肽酶活力的測定

1.3.5.1 菌體的培養(yǎng)

分別將各菌株的凍干粉連續(xù)活化3 代，按照2%～3%接種量接種于新鮮的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)至對數期，9 000×g、4 ℃離心20 min棄上清液取沉淀。利用pH 8.0、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液重復洗滌2～3 次，收集菌體，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 無細胞粗提物的制備

參考張咚咚[12]和郭宇星等[13]方法略作修改。將上述菌液進行超聲破碎，超聲功率300 W，超聲時間27 min，工作時間5 s，間隔時間3 s。超聲破碎后，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液即為粗酶液。

1.3.5.3 酶活力測定

參考張咚咚[12]和郭宇星等[13]方法略作修改。等量粗酶液進行相同倍數稀釋，取稀釋菌液0.5 mL加入至5 mL的Tris-HCl緩沖液中，在40 ℃的水浴中預熱5～10 min，加入25 mmol/L的L-亮氨酸對硝基苯胺溶液0.5 mL，40 ℃準確反應30 min，之后立即放入冰水中待冷卻后，在波長410 nm處測定吸光度，以去離子水代替酶液作為對照組。氨肽酶活力定義：在40 ℃條件下，pH 8.0時，每分鐘生成1 μg對硝基苯胺所消耗酶量為1 個酶活力單位值。

對硝基苯胺標準曲線的繪制：配制1～6 μg/mL系列質量濃度的對硝基苯胺溶液，在410 nm波長處測定吸光度，以對硝基苯胺質量濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標，繪制標準曲線。

氨肽酶活力計算如式（2）所示：

式中：V為反應的總體積/mL；ΔA為空白組與實驗組的吸光度之差；M為稀釋倍數；t為反應時間/min；v為酶液體積/mL；K為消光系數0.036 8。

1.3.6 新鮮干酪的制作

參考焦晶凱等[14]方法進行部分修改。取5 kg的無抗生牛乳，放入水浴鍋預加熱，加熱至60～65 ℃進行高壓均質，均質壓力18 MPa，牛乳均質后進行巴氏殺菌（90 ℃、5 min），在冰水中進行冷卻，冷卻至30 ℃左右進行接種，接種比例3%，接種后攪拌均勻，靜置初發(fā)酵30 min，在pH值降0.2左右加入凝乳酶，輕微攪拌均勻后放置在30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵過夜，切割凝乳1 cm×1 cm，加熱至65 ℃，排除乳清，冷卻至40 ℃，吊袋過夜，包裝，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 干酪基本理化指標的測定

蛋白質含量的測定：參考GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法；脂肪含量的測定：參考GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏提取法；水分含量的測定：采用mb45水分含量測定儀；pH值的測定：取預先放置在4 ℃保存的樣品10 g置于研缽中，研磨混勻，用pH計直接插入測定。

1.3.8 干酪質構的測定

使用TA.XT plus質構儀，采用一下壓方式，參數設置為測試前速率1 mm/s、測試速率3 mm/s、回程速率10 mm/s、觸發(fā)力1 g、測試時間5 s、測試探頭類型HDP/SR。測試前樣品裝入磨具磨平，放入4 ℃冰箱冷藏30 min，所有樣品在5 min內測試完畢，每個樣品平行測試3 次。

1.3.9 動態(tài)流變的測定

1.3.9.1 線性黏彈區(qū)的確定

結合Rosenberg[15]和Tunick[16]等方法進行干酪流變測試，使用ARES-G2流變儀，夾具類型為50 mm不銹鋼圓形平板，平板與測試臺距離設置為1 mm，測定溫度20 ℃，應變掃描范圍0.01%～10%，通過對數掃描確定恒定的振蕩應變區(qū)為線性黏彈區(qū)。

1.3.9.2 動態(tài)流變測定

在20 ℃條件下，根據以上線性黏彈區(qū)所確定的應變值0.025%，GAP設置為1 mm，在0.1～100 rad/s范圍內頻率掃描。繪制掃描頻率為橫坐標（采用對數刻度），損耗（黏性）模量G’、貯能（彈性）模量G’、復合黏度η*為縱坐標的流動曲線。

1.4 數據分析

采用Excel 2010對實驗數據進行繪圖，IBM SPSS Statistics 21軟件進行ANOVA、相關性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株在脫脂乳中的產酸性能分析

選擇干酪所用菌株時，產酸率是篩選的關鍵。在干酪加工中乳酸菌發(fā)酵分解牛乳中的乳糖而產生乳酸，乳酸的產生有利于凝乳酶發(fā)揮作用，其次增加酪蛋白中鈣組分的溶解；最后酸化程度影響凝塊的硬度大小及風味特色[17]。產酸速度影響干酪生產制作中牛乳的預酸化時間[18]。

圖1 不同菌株發(fā)酵24 h的產酸性能Fig. 1 Acid production after fermentation of skim milk with different strains for 24 hours

從圖1可以看出，不同菌株在發(fā)酵24 h后在產酸性能表現出一定差異（P＜0.05），整體上乳酸乳球菌的產酸速率較快且產酸量高，菌株E11的ΔpH（2.23±0.02）稍大于C44（2±0.01），但是兩者之間的差異并不顯著（P＞0.05）；其次是G12、N、F22、B1，后三者在產酸方面無顯著性差異；而D41的產酸性能最低。因此產酸方面可以考慮E11、C44、G12，其他產酸性能較低的菌株，后續(xù)可以通過復配產酸性能好的菌株進行使用。

2.2 菌株產黏性能分析

圖2 不同菌株的產黏性能Fig. 2 Viscosity production of different strains

乳酸菌的產黏性能對干酪的結構、組織狀態(tài)、質地有一定影響[19]。由圖2可以看出，乳酸菌發(fā)酵脫脂乳產生的發(fā)酵乳黏度在（0.125±0.002）～（0.351±0.023）Pa·s之間，其中C44和B1黏度無顯著差異（P＞0.05），且黏度值顯著高于其他組，其次是E11、N，黏度值分別為（0.264±0.019）、（0.209±0.054）Pa·s，其余菌株發(fā)酵乳的黏度值均在0.200 Pa·s以下，其中D41表現出的黏度值最低，其值為（0.125±0.002）Pa·s。很多研究表明乳酸菌黏度的表現與其產生的胞外多糖有關，張麗[20]研究發(fā)現發(fā)酵乳的黏度與胞外多糖存在顯著相關性，而且胞外多糖含量和種類對發(fā)酵乳的黏度均有一定的影響，在一定范圍內，胞外多糖含量越高發(fā)酵乳黏度越大[20]，但是含量過高會影響干酪的持水性，因此可以根據生產干酪類型的差異選擇不同特性的乳酸菌。

2.3 菌株的自溶度分析

自溶是細胞中稱為自溶素的肽聚糖水解酶對細胞壁肽聚糖的酶促切割[21]。Law[22]研究發(fā)現未成熟干酪中的發(fā)酵劑自溶度與蛋白水解呈正相關。在干酪生產過程中，乳酸菌的自溶會釋放胞內蛋白酶、肽酶、脂肪酶分解蛋白質、多肽、脂肪，從而加快干酪的成熟，改善干酪的風味及硬度及流變性質[19]，并節(jié)約成本。

圖3 不同菌株的自溶度特性Fig. 3 Characteristics of autolysis of different strains

從圖3可以看出，不同菌株自溶度有顯著差異（P＜0.05），其中D41的自溶度高達44.75%，高自溶裂解釋放出更多蛋白酶加速了體系中蛋白質的分解，產生更多水溶性成分，功能性小肽、游離氨基酸，而酪蛋白原本的凝膠網狀結構被破壞，干酪體系變得松散，從而一定程度上使得干酪的硬度下降[23]，此外這些水溶性分子間形成更多的連接鍵，重建較小的網絡結構，利于干酪保持一定的彈性[24]，而且也可使干酪進入腸胃中更易被消化吸收。E11的自溶度僅次于D41，自溶度為32.39%，其余5 株菌的自溶度在15.33%～25.7%之間，其中F22的自溶度處于最低水平。選擇自溶度適中菌株更易獲得高水平的干酪。高自溶度的菌株可以加快蛋白質的分解，更加適用于成熟干酪成熟期的應用，從而縮短干酪成熟期[11]，高自溶活性的菌株加速干酪風味的形成，但過高的自溶度會導致苦味肽、己醛等不良成分的形成，不利于干酪的風味，對干酪的硬度產生一定影響[23]。因此用于干酪生產的菌株選擇自溶度適中，既保證了一定的蛋白質水解，也對干酪風味質地產生一定貢獻。

2.4 菌株氨肽酶活力分析

干酪中蛋白質水解有蛋白酶、纖溶酶、肽酶等的參與，其中肽酶中的氨肽酶能夠降解疏水性的肽組分減輕干酪苦味[25]，小肽分子和游離氨基酸是風味物質的前體成分。

圖4 不同菌株的氨肽酶活力Fig. 4 Aminopeptidase activities of different strains

氨肽酶中具有代表性的是亮氨酸（Leu）氨肽酶，通過超聲破碎法獲取酶液，其活力測定結果如圖4所示，所有乳酸菌菌株均表現出對L-亮氨酸-4-硝基苯胺的氨肽酶活力；其中氨肽酶活力最高的是C44，其值為15.9 U/mL，其次為E11（12.30 U/mL）、D41（9.35 U/mL）、B1（6.88 U/mL）、F22（5.95 U/mL）、G12（5.42 U/mL），N具有最低的酶活力3.16 U/mL，與其他菌株存在顯著性差異（P＜0.05）。其中D41具有較高自溶度外，還具有較高的氨肽酶活力，已有研究表明，乳酸菌自溶性較大，干酪中蛋白質的次級降解程度越大，游離氨基酸水平越高，因此菌株的自溶程度與氨肽酶相關的次級分解之間有一定正相關關系[26-27]。較高的自溶度、氨肽酶活力使蛋白質分解程度高，促進產生更多風味相關物質，且干酪的酪蛋白凝膠結構被破壞從而使干酪硬度下降而變軟[28]。

2.5 新鮮干酪基本指標的測定結果

水分含量和水分活度是評價干酪在貯藏期間穩(wěn)定性的重要依據，水分含量是干酪尤其是新鮮干酪貯藏的一個至關重要的特征，另外水分含量與干酪的硬度有極大相關性，直接決定了產品的質地，水分含量較高的干酪，質地較軟，但是貯存期較短，生產中根據產品類型的不同控制其水分含量，以達到產品品質的要求。

表1 不同菌株的干酪理化數據結果Table 1 Physicochemical properties of cheeses made with different strains

由表1可知，E11、C44菌株所制干酪水分含量與對照組接近且無顯著性差異（P＞0.05），水分活度較低于對照組；F22、N所制干酪的水分含量顯著低于對照組（P＜0.05），但是水分活度與對照組并無顯著性差異（P＞0.05）。不同菌株的添加導致干酪中蛋白質、脂肪含量的顯著差異（P＜0.05）。

2.6 新鮮干酪質構分析

表2 不同菌株的干酪質構分析Table 2 Texture characteristics of cheeses made with different strains

表3 相關性分析Table 3 Correlation analysis

圖5 11菌株所制干酪的質構典型曲線Fig. 5 Typical texture curve of cheese prepared with strain E11

由表2所示，不同特性菌株制作的干酪在質構上存在顯著性差異。其中E11、C44、G12菌株所得干酪在硬度、涂抹性、黏聚力、黏著性與對照組表現相近，更加適用于新鮮干酪的制作，其中F22、N的質構表現與對照組相差較大。D41、B1與對照組相比處于中間水平。E11菌株所制干酪的質構典型曲線見圖5。根據表3相關性分析數據，菌株的產酸特性影響干酪持水性，體現在對干酪中水分含量以及水分活度的影響；水分含量的控制不僅與pH值相關[29]，也有研究表明與工藝參數[30]、巴氏殺菌的方式、壓榨程度相關[31]。如表3所示，干酪的水分含量與干酪的硬度、涂抹性呈極顯著負相關，與黏著性、黏聚力呈極顯著正相關，且硬度與涂抹性呈極顯著正相關，與黏聚力、黏著性呈極顯著負相關。水分含量對質構的影響顯著性高于水分活度、蛋白質、脂肪含量對質構的影響。此外硬度是干酪的一個至關重要的功能特性，干酪中的蛋白質基質所形成的空間結構體現了干酪的硬度[32]，于華寧等[33]研究提到干酪的硬度一般由非脂物質決定，硬質干酪的非脂物質均顯著高于軟質干酪，故硬度偏大，該結論與本研究結論一致，干酪中蛋白質與干酪的硬度呈極顯著正相關。另外自溶度、氨肽酶活力不同的菌株，在蛋白酶、脂酶等表現的不同，在硬度上存在一定的差異；菌株自溶度、氨肽酶活力高使得蛋白質和脂肪發(fā)生水解其結構發(fā)生變化，有研究表示隨著蛋白質水解程度越大，干酪的硬度、彈性呈下降趨勢[34]。

2.7 新鮮干酪動態(tài)流變分析

干酪是黏彈性的物質，既包括固體性質（彈性），又包括液體性質（黏性），其中G’代表物質材料貯存能量（彈性模量），損耗模量（黏性模量）G’代表每一個循環(huán)能量的損失[35]。如圖6所示，在20 ℃條件下，復合黏度η*隨掃描頻率的增加而降低，而G’和G’隨著掃描頻率的增加而增加。在0.1～100 rad/s頻率范圍掃描下，所有干酪的G’都顯著高于G’，且無相交點，η*逐漸下降，且所有干酪的tanδ均大于0.1（G’與G’的比值），表明干酪均表現為弱凝膠或者固體性質[36]；此外分子間以及分子內部作用也可能導致了酪蛋白顆粒的融合進而促使了該類型結構的形成[37-38]。從圖6B、C可以看出，水分越高的干酪，其黏彈性越低，使用D41菌株制作的干酪的G’和G’均大于其他菌株干酪，說明D41干酪的流變性質相較于其他的菌株干酪固體的形態(tài)更顯著，這與質構測試中的較高硬度、涂抹性相對應，該菌株可能更適用于硬質干酪的制作?？梢钥闯?，干酪的黏彈性結果與硬度的大小存在一定關聯性，此結論與于華寧[33]和Garcia[39]等結論一致。

圖6 不同菌株制作的新鮮干酪在20 ℃的η*（A）、G”（B）和G’（C）Fig. 6 Complex viscosity (A), loss modulus/viscosity modulus (B) and storage modulus/elastic modulus (C) of fresh cheeses made with different strains at 20 ℃

3 結 論

乳酸乳球菌E11、C44在0～24 h產酸快、產黏適中，自溶度和氨肽酶活力較高，在以上方面均表現較優(yōu)異。在質構上，菌株自溶度和氨肽酶活力較高的菌株釋放更多的蛋白酶和脂酶水解蛋白質和脂肪，使干酪表現為低硬度，如E11、C44。經過相關性分析得出，水分含量與干酪硬度呈極顯著負相關，水分越高的干酪，硬度越低，黏著性越高；此外干酪的pH值、蛋白質、脂肪含量也對干酪的質構有顯著正相關性。在動態(tài)流變分析中，7 種新鮮干酪的G’隨著掃描頻率的增加始終大于G’，tanδ＞0.1，即干酪的彈性屬性占主導地位，其中菌株E11、C44所制干酪在黏彈性均接近于對照組。綜上總結分析乳酸乳球菌E11、C44可考慮用于新鮮干酪發(fā)酵劑的備用，其他菌株根據特性不同后續(xù)可以通過復配進行發(fā)酵生產高功能性、高品質的干酪。