孫宗保，梁黎明，閆曉靜，鄒小波，王天真，劉小裕，李君奎

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

在我國，牛肉需求遠超過國內(nèi)供給，并且供需差距不斷擴大[1]，進口牛肉成為解決供需矛盾的重要途徑。冰鮮牛肉因其新鮮、柔嫩等特點深受消費者喜愛[2-3]，但牛肉在非冷凍條件下腐敗速度較快，保鮮時間相對較短，在一定程度上制約了其在市場上的發(fā)展。進口牛肉市場上存在不法商販為了謀取利益以次鮮肉冒充新鮮肉售賣，這不僅損害消費者利益，還可能導致食品安全問題的發(fā)生。因此有必要對不同貯藏時間冰鮮牛肉的品質(zhì)檢測進行研究。

目前對肉品品質(zhì)的研究仍主要采用感官評定、理化指標檢測和微生物檢測等常規(guī)方法[4]。感官評價有主觀性強等缺陷，理化檢測與微生物檢測多數(shù)需要復雜的操作步驟，具有樣品處理繁瑣、檢測周期長等問題[5]。為了滿足肉類品質(zhì)快速檢測與準確分析的要求，無損檢測技術(shù)逐步代替常規(guī)檢測方法運用到肉品品質(zhì)安全檢測中。其中高光譜成像技術(shù)將光譜與二維成像技術(shù)結(jié)合在一起，不僅可以獲得樣本在每個波段下的圖像信息并用于樣品的外部特征研究，還可以提取圖像上每個像素點的光譜信息并用于樣品的內(nèi)部品質(zhì)研究[6-8]。高光譜成像技術(shù)在肉品品質(zhì)檢測方面已有較多應用[9]。Kamruzzaman等[10]利用高光譜成像技術(shù)識別碎牛肉中是否摻假雞肉及其摻假濃度；Crichton等[11]利用高光譜成像技術(shù)檢測不同貯藏條件下的牛肉的pH值，成功分離出變質(zhì)牛肉；Foca等[12]研究證明高光譜成像技術(shù)可以預測干切火腿表明乳酸菌的數(shù)量?，F(xiàn)階段對牛肉單一或多種指標檢測的研究很多，但在從眾多理化指標中篩選出不同貯藏時間的冰鮮牛肉之間的新鮮度特征指標的研究還很少。通過對特征指標含量的預測可以進一步研究不同貯藏時間冰鮮牛肉的品質(zhì)差異。

本研究以不同貯藏時間的冰鮮牛肉為研究對象，重點研究牛肉貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）[13]、顏色（L*、a*、b*）、脫氧肌紅蛋白（deoxymyolglobin，DMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MMb）含量的變化，并找出不同貯藏時間冰鮮牛肉的新鮮度特征指標，然后利用高光譜成像技術(shù)預測新鮮度特征指標含量，比較不同預測模型的預測效果。最后利用最佳預測模型計算新鮮度特征指標含量，結(jié)合圖像處理方法完成特征指標含量的分布可視化[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳大利亞進口冰鮮牛腱肉購自上海新臻元食品有限公司。牛肉樣品在冰箱冷鮮層（（4±0.5）℃）進行不同時間（1、15、30、45、60 d和90 d）的冷藏，記為F-1、F-15、F-30、F-45、F-60、F-90。

氧化鎂、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸標準溶液上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高光譜成像系統(tǒng)主要組成硬件包括：ImSpector V10E CCD攝像頭 芬蘭Specim公司；SC30021A精密電控平移臺、SC300-1A電子控制箱 北京卓立漢光儀器有限公司；Fiber-Lite DC-950 Illuminator 150 W光纖鹵素燈美國Dolan-Jenner公司。

Color Quest XE分光測色儀 美國Hunter Lab公司；A25-Digital分散機 上海歐河機械設備有限公司；TGL-16MC離心機 長沙湘銳離心機有限公司；V-5100B分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的預處理

實驗前在無菌冷藏室去掉樣本中可見的脂肪、結(jié)締組織等，切成3 cm×3 cm×2 cm表面平整的塊狀樣本，編號后進行指標測定。每個貯藏時間下含有30 塊樣本，測定顏色（L*、a*、b*）并采集高光譜圖像后，再將其利用絞肉機充分攪碎后進行TVB-N和肌紅蛋白（DMb、OMb和MMb）的測定。

1.3.2 理化指標測定

1.3.2.1 TVB-N含量的測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法進行測定。

1.3.2.2 顏色的測定

L*、a*、b*代表物體顏色的色度值，其中L*代表明暗度（黑白），a*代表紅綠色，b*代表黃藍色。利用分光測色儀測定牛肉樣本的L*、a*、b*值。待測色儀開機、校正后，對每個肉樣在不同肌肉部分測定3 次取其平均值。

1.3.2.3 肌紅蛋白含量的測定

參照Krzywicke[15]的方法，首先將肉樣充分攪碎，取4 g碎肉加入20 mL、0.04 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）中，然后用分散機在室溫下10 000 r/min均質(zhì)15 s。將均質(zhì)液在4 ℃冰箱中冷藏1 h后使用離心機在5 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min。最后將上清液過濾，使用分光光度計分別在525、545、565、572 nm波長處測量濾液的吸光度。肌紅蛋白含量按照以下公式計算：

式中：P1、P2、P3分別為DMb、OMb、MMb的質(zhì)量分數(shù)/%；R1、R2、R3分別為吸光度比值A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.3 高光譜成像采集

高光譜采集參數(shù)設置為：曝光時間45 ms，圖像分辨率618×1 628，平移臺速率為90 mm/s，光譜分辨率2.8 nm，光譜波長范圍為431～962 nm，采樣間隔0.858 nm。高光譜數(shù)據(jù)采集后將得到一個三維圖像數(shù)據(jù)塊。樣本采集過程中的噪聲、暗電流會對圖像造成影響，因此對原始圖像進行校正后再提取數(shù)據(jù)。利用ENVI軟件打開牛肉樣本標定后的高光譜圖像，采用矩形工具選取每個樣本中心附近的200×200感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），計算ROI內(nèi)的所有像素點的光譜反射率作為此樣本的光譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 統(tǒng)計分析方法

采用偏最小二乘法進行定量模型的構(gòu)建。使用SPSS 25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，通過Duncan新復極差法進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著；并使用SPSS進行Pearson相關(guān)性分析。

1.4.2 光譜預處理方法

本實驗選用的預處理方法包括一階導數(shù)（first derivative，1st Der）、二階導數(shù)（second derivative，2nd Der）、均值中心化（mean centering，MC）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、卷積平滑（savitzky-golay，SG）、標準正態(tài)變量變換（standard normal variate transformation，SNVT）和歸一化（normalization，N）。將未經(jīng)預處理組分設置為對照組。

1.4.3 特征變量提取方法

區(qū)間偏最小二乘（interval partial least squares，iPLS）方法：將整個光譜區(qū)域分成若干個等寬子區(qū)間，對每個子區(qū)間構(gòu)建偏最小二乘回歸模型，采用留一法交互驗證計算交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）值，根據(jù)RMSECV最低的原則確定最佳建模區(qū)間[16]。

競爭性自適應重加權(quán)算法（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）是一種蒙特卡羅（Monte Carlo）結(jié)合偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸系數(shù)的特征波長選擇方法。它可以有效去除無關(guān)變量，減少共線性變量的影響[17]。

1.4.4 樣本集的劃分

采用Kennard-Stone劃分樣本集，以2∶1的比例劃分訓練集和預測集，得到120 個樣本作為訓練集，60 個樣本作為測試集。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標測定結(jié)果分析

為獲得較好的新鮮度預測性能，利用顯著性和相關(guān)性分析從諸多新鮮度指標中篩選出與貯藏時間相關(guān)性最優(yōu)的特征指標，然后利用預測模型計算新鮮度特征指標含量，最后結(jié)合圖像處理方法完成特征指標含量的分布可視化，以此獲得表征牛肉新鮮度的最優(yōu)可視化圖像。

圖1 不同貯藏時間冰鮮牛肉的TVB-N含量Fig. 1 TVB-N content of chilled beef during different storage times

從圖1可以看出，冰鮮牛肉的初始TVB-N含量為8.35 mg/100 g。隨著貯藏時間的延長，冰鮮牛肉中的TVB-N含量顯著性增加（P＜0.05），與肉品腐敗程度呈正相關(guān)[18-20]。當貯藏時間為45 d時，TVB-N含量接近15 mg/100 g，貯存至60 d時，TVB-N含量已經(jīng)超過國家規(guī)定。

圖2 不同貯藏時間冰鮮牛肉的顏色參數(shù)值Fig. 2 Color parameters of chilled beef during different storage times

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，冰鮮牛肉的L*值變化波動較大，貯藏初期（1、15 d）與后期（60、90 d）的L*值差異具有顯著性（P＜0.05）。b*值在貯藏15 d后達到最大，隨后逐漸降低，這與肉中微生物的繁殖以及水分損失有關(guān)。a*值整體上一直減小，但是在貯藏中期（15、30、45 d）變化不顯著（P＞0.05）。其原因是貯藏時間的延長對氧合肌紅蛋白的形成不利，并且貯藏后期細菌的大量繁殖，促進了高鐵肌紅蛋白的形成[21]，使牛肉a*值下降。

3 種肌紅蛋白的顏色分別為：DMb暗紅色（紫紅色）、OMb鮮紅色、MMb灰棕色（褐色）。根據(jù)謝小雷等[22]研究，OMb經(jīng)氧化后生成MMb，而MMb經(jīng)過高鐵肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)的作用可以被還原為OMb，這兩個反應同時進行。由圖3可知，不同貯藏時間的OMb含量差異最顯著，經(jīng)短暫上升后逐漸下降。MMb含量變化與OMb正好相反，先下降后逐漸上升，導致肉色變暗、a*值下降。這與González-Calvo等[23]研究結(jié)果相符。

圖3 不同貯藏時間冰鮮牛肉的DMb、OMb和MMb含量Fig. 3 DMb, OMb and MMb contents of chilled beef samples during different storage times

2.2 新鮮度特征指標篩選

對比圖1～3的顯著性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同貯藏時間的TVB-N含量差異最顯著。如表1所示，TVB-N、DMb和MMb與貯藏時間呈正相關(guān)，L*、a*、b*和OMb與貯藏時間呈負相關(guān)。另外，通過對比相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，TVB-N、b*、a*的相關(guān)系數(shù)均大于0.8。因此本研究從顯著差異性、正負相關(guān)性、相關(guān)系數(shù)3 個方面綜合考慮，選取TVB-N、a*和b*作為不同貯藏時間冰鮮牛肉的新鮮度特征指標。

表1 貯藏時間與理化指標間的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficients between storage time and physicochemical indexes

2.3 光譜數(shù)據(jù)預處理

圖4 冰鮮牛肉樣本的原始光譜圖（a）與平均光譜圖（b）Fig. 4 Raw Spectra (a) and average spectra (b) of chilled beef samples

從圖4可以看出，不同貯藏時間牛肉樣本之間的光譜曲線具有相似的趨勢，但是反射率存在差異。在560 nm波長附近主要是脫氧肌紅蛋白的吸收峰，700 nm波長附近的光譜吸收與NH3基團的三級倍頻吸收有關(guān)，800 nm波長附近的光譜吸收主要與水分子中O—H鍵的二級倍頻吸收有關(guān)[24-26]。光譜信息中存在著部分與樣本自身性質(zhì)不相關(guān)的冗雜信息，這會影響模型的穩(wěn)定性與預測的準確度[27-28]。因此采用7 種不同的預處理方法（1st Der、2nd Der、MC、MSC、SG、SNVT和N）對原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理。

2.4 新鮮度特征指標含量預測

根據(jù)2.2節(jié)的結(jié)論，將TVB-N、a*和b*作為不同貯藏時間的冰鮮牛肉的新鮮度特征指標。利用PLS、iPLS、CARS-PLS模型對上述指標含量進行預測。在建立模型之前，采用Kennard-Stone方法進行樣本集劃分，且訓練集中樣本的每個特征指標含量范圍包含測試集中樣本對應的指標含量，有助于預測模型精度的提升。

2.4.1 TVB-N含量的預測

2.4.1.1 PLS模型預測結(jié)果

如表2所示，當原始光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過SNVT方法預處理后，PLS模型的預測效果較好，訓練集和測試集的相關(guān)系數(shù)rc和rp分別為0.938 2、0.925 4，RMSECV值和RMSEP值分別為1.46、1.49 mg/100 g。后續(xù)實驗采用SNVT方法進行預處理。

表2 不同預處理方法建立TVB-N含量PLS模型預測結(jié)果Table 2 Predictive results of PLS model for TVB-N content with different preprocessing methods

2.4.1.2 iPLS模型預測結(jié)果

首先將預處理后的618 個變量分成10～30 個區(qū)間，然后對每一區(qū)間建立PLS模型。當i=10時，主成分數(shù)為8，RMSECV值最小為0.851 7 mg/100 g，如圖5a所示。此時iPLS篩選的最優(yōu)子區(qū)間為第4個，圖5b顯示了最優(yōu)子區(qū)間的位置，對應波長范圍587.36～639.17 nm，一共62 個變量。將這些變量組合成新矩陣并建立PLS預測模型，預測結(jié)果如圖5c、d所示。與全光譜變量建立的預測模型結(jié)果相比較，訓練集和測試集的識別率均有不同程度的下降。這是因為，雖然iPLS在提取變量過程中去除了大量的變量，但提取出來的變量是連續(xù)的，相鄰或者相互之間可能會存在高度相關(guān)性[29]。

圖5 TVB-N含量的iPLS模型的最佳主成分（a）、最優(yōu)子區(qū)間（b）、訓練集（c）和測試集（d）散點圖Fig. 5 iPLS model for TVB-N content: optimum PCs (a), optimum subintervals (b), and scatter plots of training (c) and test set (d)

2.4.1.3 CARS-PLS模型預測結(jié)果

圖6 TVB-N含量的CARS-PLS模型的變量選擇Fig. 6 CARS-PLS model results of TVB-N content

利用CARS篩選波長時，采樣次數(shù)設置為100，運行結(jié)果如圖6和圖7所示。圖6a為不同采樣次數(shù)下選取的變量數(shù)量，其隨采樣次數(shù)的增加逐漸減小；由圖6b可知，RMSECV值隨著采樣次數(shù)的增加先減小后增大，當采樣次數(shù)為35時，RMSECV值最?。粓D6c表示波長選擇過程中不同波長變量對應的回歸系數(shù)的變化路徑，*表示RMSECV值最小的位置，此時共篩選得到65 個波長。將這65 個特征波長變量組合后建立PLS預測模型，結(jié)果如圖7所示，rc和rp分別為0.965 8和0.963 7，RMSECV值和RMSEP值分別為1.06、1.12 mg/100 g。與全光譜建模結(jié)果相比，預測精度有所提高。說明通過CARS方法去除無關(guān)變量后，可以簡化模型，降低模型的計算量，提高運算效率并提高模型預測精度[30-31]。

圖7 TVB-N含量的CARS-PLS模型的最佳主成分數(shù)（a）、訓練集（b）和測試集（c）散點圖Fig. 7 CARS-PLS model results of TVB-N: optimum PCs (a), and scatter plots of training (b) and test set (c)

2.4.2a*和b*值的預測結(jié)果

2.4.2.1 PLS模型預測結(jié)果

表3 a*和b*值的PLS模型預測結(jié)果Table 3 Predictive results of PLS models for a* and b* values

如表3所示，對照組對a*的預測結(jié)果最好，說明利用原始光譜數(shù)據(jù)建立a*的PLS預測模型效果最佳，rc和rp分別為0.930 1、0.914 8，RMSECV值與RMSEP值分別為0.85、0.90；MSC是預測b*值的最佳預處理方法，rc和rp分別為0.912 8和0.902 0，RMSECV值與RMSEP值分別為1.04和1.24。

2.4.2.2 iPLS、CARS-PLS模型預測結(jié)果

表4 a*和b*值的iPLS、CARS-PLS and iCARS-PLS模型結(jié)果Table 4 Results of iPLS, CARS-PLS and iCARS-PLS models for a* and b * values

利用iPLS和CARS方法分別對經(jīng)過上述最佳預處理方法處理后的數(shù)據(jù)進行特征提取，然后將變量組合成新數(shù)據(jù)矩陣并建立a*和b*值PLS預測模型，結(jié)果如表4所示。相比于iPLS和全光譜建立的PLS模型結(jié)果，CARS-PLS模型的預測精度有非常明顯的提升。此時對a*值和b*值進行預測時，rc分別為0.949 5、0.964 2，rp分別為0.949 4、0.942 3，RMSECV值分別為0.71、0.76，RMSEP值分別為0.72、0.77。

2.5 新鮮度特征指標含量分布可視化

利用CARS-PLS模型實現(xiàn)TVB-N、a*和b*值的可視化分布，便于更加直觀地分析牛肉的品質(zhì)變化。

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，圖像顏色由藍色逐漸轉(zhuǎn)為黃色。圖8e、f基本為綠色和黃色，與圖8a～d差異明顯。對應的牛肉樣本TVB-N含量均值大于15 mg/100 g，牛肉新鮮度明顯降低。

圖8 不同貯藏時間牛肉中TVB-N的可視化分布圖Fig. 8 TVB-N distribution maps of beef samples at different storage time pints

在圖9a、b中，黃色像素點和紅色像素點居多，a*值較大；圖9c紅色像素點基本消失，以黃色和淺藍色像素點為主；圖9d～f中像素點由淺藍色逐漸向深藍色轉(zhuǎn)變，表明a*值隨著貯藏時間的延長逐漸下降。

圖9 不同貯藏時間牛肉中a*值的可視化分布圖Fig. 9 a* Distribution maps of beef samples at different storage time points

圖10 反映了b*值變化情況。隨著貯藏時間的延長，圖像顏色整體由黃色向藍色轉(zhuǎn)變。其中，圖10a、b中黃色像素點增多，b*值增大，而圖10b～e中黃色像素點不斷減少，藍色像素點不斷增多，表明貯藏15 d后b*值開始減小。

圖10 不同貯藏時間牛肉中b*值的可視化分布圖Fig. 10 b* Distribution maps of beef samples at different storage time points

因此，通過新鮮度特征指標的可視化分布圖可以更直觀地看出冰鮮牛肉在貯藏過程中新鮮度的變化趨勢，幫助消費者以及生產(chǎn)者判斷牛肉的新鮮程度。

3 結(jié) 論

本研究以不同貯藏時間的冰鮮牛肉為研究對象，采集樣本的高光譜圖像、測定并分析樣本的TVB-N、顏色參數(shù)（L*、a*、b*）、DMb、OMb和MMb含量變化，結(jié)果表明TVB-N、a*、b*值與貯藏時間呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，選取了TVB-N、a*和b*作為不同貯藏時間的冰鮮牛肉的新鮮度特征指標。同時利用光譜數(shù)據(jù)對特征指標含量進行預測，最佳預測模型均為CARS-PLS。此時，模型的rp分別為0.963 7、0.949 4、0.942 3，RMSEP分別為1.12 mg/100 g、0.72、0.77。利用CARS-PLS模型結(jié)合圖像處理繪制了特征指標含量可視化分布圖，可以直觀地看出冰鮮牛肉在貯藏過程中新鮮度的變化趨勢。結(jié)果表明，高光譜成像技術(shù)結(jié)合化學計量學方法可以實現(xiàn)冰鮮牛肉新鮮度指標的快速檢測及其分布可視化。