林麗珊，傅武勝,，張一可，高 博，藍(lán)麗華，龐 杰

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000；2.福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；3.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 福州 350122；4.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州 350003；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

氯丙醇酯（chloropropanols esters，MCPDE）和縮水甘油酯（glycidyl esters，GE）是在熱加工處理或氯離子作用下形成的一類食品加工過程污染物[1-3]。2012年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將3-氯丙醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）和縮水甘油（glycidol，Gly）分別列為2B、2A類致癌物[4-5]。2017年，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）確定了人體對(duì)3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-chloro-1,2-propanediol fatty acid ester，3-MCPDE）的每日最大允許耐受量（tolerable daily intake，TDI）為2.0 μg/（kg·d），食品添加劑委員會(huì)將其暫定為4.0 μg/（kg·d）[6]。這些污染物普遍存在精煉食用油等油脂性食品中[7-8]，嬰幼兒配方奶粉（以下簡(jiǎn)稱嬰配）含有約20%的脂肪，其主要來自于生產(chǎn)中添加的食用植物油，因此容易造成MCPDE和GE的污染[9]。對(duì)于嬰兒，配方乳粉是母乳的唯一替代品，因此此類物質(zhì)引起的食品安全問題一直倍受國際關(guān)注。2016年EFSA報(bào)道歐盟地區(qū)嬰配中3-MCPDE和GE的平均含量分別為0.108、0.087 mg/kg（以奶粉計(jì)）[10]。Arisseto等[11]報(bào)道巴西市售嬰配3-MCPDE和GE的平均含量分別高達(dá)0.150、0.220 mg/kg，由此評(píng)估0～5 月齡嬰兒3-MCPDE的平均攝入量達(dá)2.49 μg/（kg·d），超過EFSA提出的TDI，1 歲以下嬰兒GE的暴露邊界比（margin of exposure，MOE）為2 793～6 635，明顯小于界限值（25 000），顯示存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。上述產(chǎn)品中GE均值也超過了歐盟制訂的限量值（0.050 mg/kg，以奶粉計(jì)）[12]。

目前有關(guān)MCPDE和GE測(cè)定方法的研究多集中于食用植物油，針對(duì)嬰配基質(zhì)的報(bào)道較少。由于嬰配生產(chǎn)中添加的配料種類多，加上生產(chǎn)工藝復(fù)雜且產(chǎn)品之間差異大，因此嬰配中該類物質(zhì)測(cè)定的難度較大，影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多，尤其脂肪的提取和水解步驟影響較大。一般待測(cè)物MCPDE和GE隨脂肪一起從嬰配中提取出來，提取方法主要有加速溶劑提取法[13]或加壓溶劑提取法[14]、液-液萃取法[15]和堿水解法[16]。待測(cè)物定量的方法有直接法和間接法2 種，直接法采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定各單體物質(zhì)的方式實(shí)現(xiàn)[15-17]，因此結(jié)果通常偏低且測(cè)定成本高；間接法能獲得總量，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但操作步驟較為繁瑣，需經(jīng)水解（酯交換反應(yīng)）、衍生后再以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定，通過檢測(cè)水解產(chǎn)物的衍生物而得到MCPDE和GE的含量，水解方法有酸水解[18-19]、堿水解[20-22]以及酶解法[23]。目前國內(nèi)外均無此類物質(zhì)的法定強(qiáng)制性檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)化方法僅有美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）法[24]，該法一開始就在嬰配中加入內(nèi)標(biāo)后提取，而更多報(bào)道采用在提取出的脂肪中加入內(nèi)標(biāo)再進(jìn)行預(yù)處理的做法。我國報(bào)道了嬰配中MCPDE[25]或GE[26]一類物質(zhì)的測(cè)定方法，無法實(shí)現(xiàn)3 類物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定。為此，在本實(shí)驗(yàn)室建立的食用油MCPDE和GEGE測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，建立同時(shí)測(cè)定嬰配中這3 類物質(zhì)的方法，并對(duì)重要因素進(jìn)行了優(yōu)化，取得較好效果，該方法已被編入我國食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)，在全國推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰配（編號(hào)為A及YL-34） 市售。

氨水、乙醇、乙醚、石油醚（30～60 ℃）、硫酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃、甲醇、正己烷、異辛烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；七氟丁酰基咪唑衍生（N-heptafluorobutyrylimidazole，HFBI） 北京百靈威科技有限公司；高效脫水劑、硅藻土固相萃取小柱（1.5 g/45 mL，另含3.0 g硅藻土分散劑） 福州勤鵬生物科技公司；去離子水由實(shí)驗(yàn)室制備。

3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯（純度98%，CAS號(hào)51930-97-3）、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸二酯（純度98%，CAS號(hào)267-56-4）、縮水甘油棕櫚酸酯（純度95%，CAS號(hào)7501-44-2）及對(duì)應(yīng)同位素D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯（純度99%，CAS號(hào)1185057-55-9）、D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸二酯（純度99%）、D5-縮水甘油-棕櫚酸酯（純度97.5%） 加拿大TRC公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-7000B氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；G-560E型旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；DKN602型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 日本Yamato公司；CP225D電子天平（感量至0.01 mg） 德國Sartorious公司；YP202電子天平（感量至0.01 g）上海精密科學(xué)儀器公司；BM510-RE801旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本Yamato公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州金壇精達(dá)儀器制造公司；EFAA-DC24氮吹儀 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪的提取和測(cè)定

參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》[27]并進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。嬰配稱樣量經(jīng)優(yōu)化由5.00 g減少為1.50 g，氨水用量為3.0 mL，其余有機(jī)溶劑用量也按照相應(yīng)比例進(jìn)行調(diào)整。

1.3.1.1 嬰配的稱樣量

分別稱取1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g奶粉于15 支50 mL塑料離心管中，保持與GB 5009.6—2016[27]相同的料液比加入有機(jī)溶劑，每組（稱樣量）重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，以奶粉計(jì)。

1.3.1.2 氨水用量

準(zhǔn)確稱取1.50 g嬰配于15 支50 mL離心管中，加入5 mL熱水（65±5）℃分散后，于對(duì)應(yīng)的離心管中分別加入氨水1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，進(jìn)行脂肪提取及后續(xù)目標(biāo)含量的測(cè)定，每組重復(fù)操作3 次實(shí)驗(yàn)，以奶粉計(jì)。

1.3.1.3 干燥方式

準(zhǔn)確稱取1.50 g嬰配于9 支50 mL離心管中，將所得提取液濃縮后，采用3 種方式干燥脂肪，對(duì)比干燥方式對(duì)MCPDE和GE測(cè)定結(jié)果的影響，具體為真空干燥（50～60 ℃、2 h）、國標(biāo)干燥法（105 ℃、2 h）[27]和高溫干燥法（120 ℃、2 h），每個(gè)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.2 MCPDE與GE含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取脂肪0.100 g（精確至1 mg），加入混合內(nèi)標(biāo)液后渦旋，先進(jìn)行溴代將GE轉(zhuǎn)化為3-溴丙醇酯，再采用酸水解法進(jìn)行酯交換，將待測(cè)物水解為3-MCPD、2-MCPD和3-溴丙醇；水解液經(jīng)堿中和后，用基質(zhì)分散固相萃取法凈化，洗脫液充分脫水后濃縮，經(jīng)HFBI衍生后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，采用同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)3-MCPDE、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯（2-chloro-1,3-propanediol fatty acid ester，2-MCPDE）和GE定量，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[28]。

1.3.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

氣相色譜條件：參考文獻(xiàn)[28]方法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1.0 μL；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣，恒流，流速0.8 mL/min；程序升溫：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min升溫至100 ℃，再以40 ℃/min升溫至300 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離能量70 eV；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲3.75 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

若未經(jīng)特別說明以脂肪計(jì)（脂肪干燥實(shí)驗(yàn)結(jié)果），本實(shí)驗(yàn)MCPDE及GE含量均以奶粉計(jì)。用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過SPSS 17軟件進(jìn)行顯著性分析，并以O(shè)rigin 8.5軟件作圖。嬰配中MCPDE、GE的含量按下式計(jì)算：

式中：X為嬰配中MCPDE、GE的含量（分別以氯丙醇、縮水甘油計(jì)）/（μg/kg）；W為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的脂肪中MCPDE和GE的質(zhì)量/ng；m為嬰配脂肪的質(zhì)量/g；f為嬰配中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的建立

圖1 嬰配基質(zhì)FAPAS 2656中MCPD與Gly衍生物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of MCPD and Gly derivatives in infant formula matrix FAPAS 2656

表1 MCPD和3-MBPD定量、定性離子對(duì)及碰撞電壓Table 1 Quantitative, qualitative ion pairs and collision voltage for MCPD and 3-MBPD

將MCPD、MBPD及其同位素用乙酸乙酯配制為20 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)液，用HFBI衍生后，用全掃描方式進(jìn)行測(cè)定，以此獲得各物質(zhì)的特征離子。選擇特征離子對(duì)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖1、表1所示，目標(biāo)物能從干擾雜質(zhì)中得到有效分離，確保了準(zhǔn)確定量。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 嬰配稱樣量

表2 稱樣量對(duì)MCPD和G的影響Table 2 ffect of sample mass on the determination of MCPD and G

表2 稱樣量對(duì)MCPD和G的影響Table 2 ffect of sample mass on the determination of MCPD and G

化合物 含量/（μg/kg）1.00 g 1.50 g 2.00 g 2.50 g 3.00 g 3-MCPDE 176 183 183 183 183 2-MCPDE 63.5 65.2 68.5 67.2 65.7 GE 15.3 11.0 11.6 12.7 12.2

如表2所示，樣品稱取量在1.00～3.00 g之間時(shí)，測(cè)得3-MCPDE、2-MCPDE和GE含量基本一致，平均值分別為181.6、66.0、12.6 μg/kg，重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard derivation，RSD）均小于10%（n=3）。在單因素方差分析中，P0.05分別為0.838、0.311、0.125均大于0.05，表明嬰配樣品的均勻度高，稱樣量對(duì)MCPDE和GE含量測(cè)定均無顯著性影響。但稱取1.00 g時(shí)，所得脂肪僅為0.20 g左右，無法滿足多次測(cè)定的用量；稱取1.50 g時(shí)，得到的脂肪約為0.30 g，可滿足后續(xù)2～3 次測(cè)定所需要的量。但樣品量過多時(shí)，有機(jī)溶劑使用量較多，同時(shí)影響操作效率，如無法使用50 mL離心管進(jìn)行振蕩提取。因此確定最佳稱樣量為1.50 g。

2.2.2 氨水用量

表3 氨水用量對(duì)MCPD和G含量的影響Table 3 ffect of ammonia on the determination of MCPD and G

表3 氨水用量對(duì)MCPD和G含量的影響Table 3 ffect of ammonia on the determination of MCPD and G

化合物 含量/（μg/kg）1.0 mL 2.0 mL 3.0 mL 4.0 mL 5.0 mL 3-MCPDE 211 209 186 233 196 2-MCPDE 61.2 71.6 62.1 59.6 63.6 GE 25.3 31.4 28.9 23.6 23.7

如表3所示，當(dāng)氨水用量在1.0～5.0 mL之間變化時(shí)，測(cè)得樣品中3-MCPDE、2-MCPDE和GE的含量分別為186～213、59.6～71.6 μg/kg和23.6～31.4 μg/kg。方差分析3-MCPDE、2-MCPDE的P值（概率）分別為0.057、0.140，表明提取過程中氨水用量對(duì)3-MCPDE、2-MCPDE測(cè)定無顯著影響（P＞0.05）；GE的P值為0.005（F0.05=7.18，組間差異），表明氨水用量對(duì)GE測(cè)定有顯著性差異（P＜0.05），但當(dāng)氨水用量在1.0～3.0 mL之間時(shí)，GE測(cè)定值無顯著差異（P=0.075）。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)待測(cè)物而言，1.0～3.0 mL的氨水對(duì)測(cè)定均無顯著性差異，但考慮到Rose Gottlieb Method[29]、GB 5009.6—2016[27]中測(cè)定嬰配脂肪含量時(shí)，氨水的適宜用量為3.0 mL。因此采用3.0 mL的氨水量時(shí)，能充分滿足這些指標(biāo)準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。

2.2.3 脂肪干燥

圖2 脂肪干燥對(duì)MCPD和G含量的影響Fig. 2 Effect of fat drying on the determination of MCPDE and GE

MCPDE和GE為食品加工過程中形成的污染物，溫度是極其重要的影響因素[30]。因此，在提取過程中，比較3 種脂肪干燥溫度方式對(duì)MCPDE和GE測(cè)定結(jié)果的影響，見圖2。3 種脂肪干燥溫度對(duì)其無顯著性影響（P＞0.05），重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)時(shí)RSD均小于10%，這說明在120 ℃以下的溫度干燥脂肪，均不會(huì)造成目標(biāo)物含量的顯著增加，但干燥溫度仍然對(duì)3-MCPDE測(cè)定具有一定的影響，隨溫度升高測(cè)定值略有增加；干燥溫度由低到高，測(cè)得平均含量分別為784、800 μg/kg和888 μg/kg，顯示120 ℃干燥1 h時(shí)導(dǎo)致3-MCPDE測(cè)定值明顯偏高，達(dá)13.3%，而在105 ℃干燥1 h時(shí)測(cè)定值800 μg/kg僅略高于真空干燥時(shí)測(cè)定值，增加2.0%，幾乎可忽略不計(jì)。考慮到真空干燥設(shè)備不是通常配備的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，因此選擇105 ℃常壓加熱1 h的條件對(duì)脂肪進(jìn)行干燥。

2.3 方法學(xué)指標(biāo)考察結(jié)果

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

表43 -MCPD、2-MCPD與G的檢出限與線性方程Table 4 LODs and linear equations for 3-MCPD, 2-MCPD and G

表43 -MCPD、2-MCPD與G的檢出限與線性方程Table 4 LODs and linear equations for 3-MCPD, 2-MCPD and G

質(zhì)量濃度范圍/（μg/mL）化合物 線性方程 線性范圍/（μg/kg）檢出限/（μg/kg）定量限/（μg/kg）3-MCPDE y=0.006 6x＋0.022 100～2 000 0.01～0.20 5 15 2-MCPDE y=0.007 9x＋0.010 3 100～2 000 0.01～0.20 5 15 GE y=0.003 1x＋0.013 7 100～2 000 0.01～0.20 10 30

以不含待測(cè)物空白油為基質(zhì)，計(jì)算信噪比。檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）[31]結(jié)果見表4。分別以3-MCPD、2-MCPD及Gly表示3-MCPDE、2-MCPDE及GE的含量。將3-MCPD、2-MCPD及GE與其各自內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值Y和脂肪中待測(cè)物的質(zhì)量X（ng，以醇計(jì)）進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。

2.3.2 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

嬰配（YL-34）的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.5%，3-MCPDE、2-MCPDE和GE的含量（以奶粉計(jì)）分別為21.3、8.20、5.34 μg/kg，本底值較低，因此適合加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。向提取的脂肪中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)含量分別為100、400、1 000 μg/kg；以奶粉計(jì)時(shí)，加標(biāo)含量分別為20.5、82.0、205 μg/kg，其中82.0 μg/kg與歐盟規(guī)定的GE限量值（75.0 μg/kg）較為接近。在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度，分別以重復(fù)6 次回收率和RSD表示，結(jié)果見表5。

表5 嬰配的加標(biāo)回收率和RSD結(jié)果（n=6）Table 5 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPD, 2-MCPD and Gfrom infant formula (n= 6)

表5 嬰配的加標(biāo)回收率和RSD結(jié)果（n=6）Table 5 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPD, 2-MCPD and Gfrom infant formula (n= 6)

注：1～6為重復(fù)次數(shù)。

化合物 加標(biāo)含量/（μg/kg）測(cè)定值/（μg/kg）回收率/% RSD/%1 2 3 4 5 6 3-MCPDE 20.5 22.8 103 108 104 96.9 111 114 8.5 82.0 83.5 97.3 98.4 106 102 104 114 6.0 205 204 93.2 104 100 102 97.1 99.4 3.7 2-MCPDE 20.5 18.2 103 106 98.4 90.4 89.0 81.5 10 82.0 72.0 95.9 96.9 95.5 92.4 87.8 91.6 3.6 205 194 95.3 98.2 94.8 95.5 101 100 2.6 20.5 19.8 96.6 107 90.5 91.9 94.0 89.4 6.7 82.0 78.3 94.4 94.8 93.8 100 91.5 84.7 5.5 205 204 101 103 98.0 104 96.6 94.3 3.9 GE

由表5可知，該嬰配在20.5～205 μg/kg水平下進(jìn)行6 次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，3-MCPDE、2-MCPDE及GE的回收率分別為93.2%～114%、81.5%～106%和84.7%～107%，RSD在2.6%～10%之間，說明優(yōu)化后的方法具有較好的準(zhǔn)確度和精確度，滿足方法學(xué)指標(biāo)的要求。

2.4 FAPAS 2656考核樣品測(cè)定結(jié)果

采用所建立的測(cè)定方法參加2019年英國食品與環(huán)境研究院舉辦的國際能力驗(yàn)證[32]，項(xiàng)目編號(hào)為FAPAS 2656，樣品基質(zhì)為嬰幼兒配方乳粉，由此更好地驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。全球共29 個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加該次能力驗(yàn)證，但結(jié)果提交率僅為81%；在提交結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室中，3-MCPDE和2-MCPDE的滿意率（|Z|＜2）較低，分別為56%（15/27）和68%（15/22）。3-MCPDE、2-MCPDE的指定值分別為44.0、16.4 μg/kg，采用本方法測(cè)得含量分別為35.2、17.7 μg/kg，對(duì)應(yīng)Z值分別為－0.9和0.4，結(jié)果滿意（Z＜2.0），表明所建立的方法準(zhǔn)確可靠。但本實(shí)驗(yàn)測(cè)定GE含量為21.7 μg/kg，由于各實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的GE含量較為分散，無法用Z值進(jìn)行評(píng)定和統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)嬰配脂肪提取、制備過程中的3 個(gè)因素進(jìn)行研究，考察其對(duì)后期MCPDE和GE含量測(cè)定的影響，并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和性能考察，重點(diǎn)是采用加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，對(duì)方法的準(zhǔn)確度和精密度指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在脂肪提取過程中，嬰配稱樣量、氨水用量以及干燥方式對(duì)后續(xù)脂肪中MCPDE和GE含量測(cè)定均無顯著性差異，但考慮氨水添加量對(duì)GE以及干燥方式對(duì)3-MCPDE的影響，以嬰配稱樣量為1.50 g、氨水用量為3.0 mL、105 ℃干燥1 h為實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件。優(yōu)化后方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均較為理想，同時(shí)參加國際能力考核（FAPAS 2656），測(cè)定結(jié)果Z值小于1.0，獲得滿意成績(jī)，更進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的精確度和準(zhǔn)確度。該方法也被指定作為國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)方法，在全國推廣應(yīng)用，為有關(guān)監(jiān)測(cè)工作提供了可靠的技術(shù)支撐。