趙天嬌，黃 瓊，魏 偉

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要特征為胰島素分泌不足或胰島素抵抗[1]。胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致肝臟、肌肉和脂肪組織對(duì)一定量的胰島素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平，造成葡萄糖攝取和糖原合成受損等[2-3]。

胰島素抵抗與胰島素信號(hào)通路的密切相關(guān)，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)缺陷均可引起抵抗，如胰島素受體(insulin receptor，InsR)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)等蛋白缺陷均可導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路的失調(diào)[4-6]。

格列齊特是一種磺脲類降糖藥[8]，通過(guò)特異性的關(guān)閉胰島β細(xì)胞膜上KATP通道促胰島素分泌[8]，也可通過(guò)增加InsR磷酸化改善C2C12肌肉細(xì)胞胰島素抵抗[9]；促進(jìn)GLUT4膜轉(zhuǎn)移改善過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗[10]。但是，格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的機(jī)制尚未完全闡明[8-11]。該研究旨在探討格列齊特改善T2DM肝臟胰島素抵抗的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)、胰島素、格列齊特(美國(guó)Sigma公司)；InsR抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：20433-1-AP，濃度：1 ∶1 000)、PI3K抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：4G3C11, 濃度：1 ∶1 000)、GSK3β抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：22104-1-AP，濃度：1 ∶1 000)、β-Actin抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：66009-1-lg，濃度：1 ∶1 000)；IRS1抗體(美國(guó)Affinity Bioscience公司, 貨號(hào): AF3272濃度：1 ∶500)、GLUT4抗體(美國(guó)Affinity Bioscience公司，貨號(hào)：AF5386, 濃度：1 ∶500)；p-IRS1抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab131487，濃度：1 ∶500)、p-GSK3β抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab75745，濃度：1 ∶500)；葡萄糖試劑盒(南京建成公司)；糖原試劑盒(北京索萊寶公司)；辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG二抗、辣氧過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1T2DM動(dòng)物模型的制備 C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分出8只作為正常組。其余小鼠喂以4周高脂飼料，自由進(jìn)水；第5周末，連續(xù)3 d腹腔注射STZ(60 mg/kg)誘導(dǎo)T2DM模型。72 h后剪尾采血測(cè)量空腹血糖，以禁食12 h血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)為是成功[12]，并隨機(jī)分為T2DM組、格列齊特低劑量組(5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)，每組8只。格列齊特每日灌胃給藥一次，共4周；正常組和T2DM組生理鹽水灌胃。

1.2.2HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立與分組 HepG2細(xì)胞株用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔(100 μl)種于96孔培養(yǎng)板，80%融合后，對(duì)照組加正常培養(yǎng)液，胰島素刺激組加1 μmol/L胰島素的培養(yǎng)液，分別刺激24、36、48 h。孵育結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，換上含2%血清的無(wú)酚紅培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液上清中的葡萄糖含量。葡萄糖消耗量=空白孔中葡萄糖含量-測(cè)定孔中葡萄糖含量。確定最佳作用時(shí)間。

確定胰島素最佳時(shí)間后，用10、1 μmol/L，100、10 nmol/L胰島素的培養(yǎng)液選擇胰島素最佳濃度。胰島素抵抗細(xì)胞模型建立后，設(shè)置對(duì)照組、胰島素刺激組、格列齊特組(2.5、5、10 mmol/L)。

1.2.3葡萄糖代謝指標(biāo)的測(cè)定 給藥期間每周測(cè)定小鼠空腹血糖1次。檢測(cè)前小鼠禁食不禁水10 h，尾尖取血。給藥前，正常組和T2DM組小鼠進(jìn)行腹腔注射糖耐量試驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)；給藥結(jié)束后，各組均行IPGTT。小鼠禁食不禁水10 h后，腹腔注射1g/kg葡萄糖；于注射后0、15、30、60、120 min尾尖血測(cè)血糖，計(jì)算血糖-時(shí)間曲線下面積(area under the curve，AUC)。

1.2.4血清生化指標(biāo)的測(cè)定 給藥結(jié)束后，動(dòng)物禁食12 h后眼眶取血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清中胰島素水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=(空腹血糖)×(空腹血清胰島素)/22.5。

目前，有許多類型的在中國(guó)的混凝土攪拌機(jī)，但按照混合攪拌機(jī)的結(jié)構(gòu)，不同材料的混合，混合機(jī)的要求是不一樣的，攪拌質(zhì)量好，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，使用方便，地基穩(wěn)定性，根據(jù)這些要求和混凝土攪拌機(jī)的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.2.5肝臟組織的處理與收集 頸部脫臼處死小鼠，迅速取出肝組織，用生理鹽水洗凈后，固定于4%多聚甲醛或保存于-80 ℃。

1.2.6胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量的測(cè)定 葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗的變化。糖原測(cè)定試劑盒檢測(cè)糖原含量，將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔(100 μl)種于24孔培養(yǎng)板，1 μmol/L胰島素處理48 h，SpectraMax M5分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(620 nm)[14]。

1.2.7Western blot法 裂解液提蛋白，InsR、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-GSK3β/GSK3β、GLUT4抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 格列齊特改善T2DM小鼠空腹血糖4周高脂聯(lián)合3次小劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠空腹血糖值均≥11.1 mmol/L，造模成功。格列齊特低、中、高劑量組給藥4周后均降低T2DM小鼠的空腹血糖水平(F=114.9，P<0.01)，提示格列齊特具有降血糖作用 (圖1、表1、2)。

圖1 格列齊特對(duì)T2DM小鼠空腹血糖的影響(n=8)

表1 格列齊特給藥0和4周T2DM小鼠空腹血糖水平

表2 格列齊特給藥4周T2DM小鼠空腹血糖水平

2.2 格列齊特改善T2DM小鼠葡萄糖耐量給藥前，T2DM組小鼠腹腔注射葡萄糖后2 h內(nèi)的血糖水平一直居高不下，且2 h后無(wú)法恢復(fù)到初始水平；T2DM組小鼠AUC較正常組升高(F=185.052，P<0.01)(圖2)，提示T2DM組小鼠糖耐量異常。

給藥結(jié)束后，T2DM組小鼠空腹血糖及腹腔注射葡萄糖后2 h內(nèi)的血糖水平較同期正常組升高，且2 h后血糖無(wú)法恢復(fù)到初始水平，提示其葡萄糖耐量異常；格列齊特治療組小鼠血糖水平較同期T2DM組均降低，2 h后血糖恢復(fù)到初始水平。 T2DM小鼠AUC較正常對(duì)照組升高，格列齊特治療組AUC較T2DM組小鼠降低，提示格列齊特低、中、高劑量組均可改善T2DM小鼠糖耐量異常(F=26.185，P<0.01)(圖2)。

2.3 格列齊特對(duì)T2DM小鼠血清胰島素和胰島素敏感性的影響與正常組比較，T2DM組小鼠血清胰島素水平降低，格列齊特治療組小鼠血清胰島素水平較T2DM組小鼠升高，提示格列齊特可以促進(jìn)胰島素分泌(F=24.443，P<0.01)(圖3A)。T2DM組小鼠HOMA-IR較正常組升高，格列齊特治療組HOMA-IR較T2DM組降低(F=21.252，P<0.05)，提示格列齊特可以改善T2DM小鼠胰島素抵抗(圖3B)。

2.4 格列齊特保護(hù)T2DM胰島素抵抗小鼠肝損傷肝臟HE染色表明，正常組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，邊界清晰；T2DM小鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，伴有脂質(zhì)空泡，核質(zhì)破裂，結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的壞死；格列齊特各劑量組均可以改善肝臟的理變化，減少脂質(zhì)空泡和肝細(xì)胞壞死，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，且格列齊特10 mg/kg和格列齊特20 mg/kg較格列齊特5 mg/kg保護(hù)作用好。表明格列齊特可以保護(hù)T2DM小鼠肝臟損傷(圖4)。

2.5 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的最佳濃度和作用時(shí)間胰島素作用24、36、48、60 h均可造成HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量下降(F=4.562，P<0.05)，48 h葡萄糖消耗量最小，因此確定胰島素最佳作用時(shí)間為48 h(圖5A)。100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L濃度的胰島素刺激48 h后(F=3.192，P<0.01)，HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量下降，且1 μmol/L胰島素刺激組的葡萄糖消耗量最小，故將此濃度作為胰島素最佳濃度(圖5B)。

2.6 格列齊特改善胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量與對(duì)照組比較，胰島素刺激組葡萄糖消耗量下降；與胰島素組比較，格列齊特組葡萄糖消耗增加(F=13.111，P<0.01)(圖6A)。胰島素刺激組糖原含量較對(duì)照組減少，格列齊特各濃度組較模型組糖原含量增多，提示格列齊特可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量，10 mmol/L效果最佳(F=38.968，P<0.05)(圖6B)。

2.7 格列齊特上調(diào)T2DM小鼠和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路格列齊特可以增加T2DM小鼠肝組織和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞InsR(FInsR,肝=91.093,P<0.01;FInsR,HepG2=76.479,P<0.01)和PI3K(FPI3K,肝=96.319，P<0.01；FPI3K,HepG2=93.645,P<0.01)的表達(dá)，促進(jìn)IRS1磷酸化(Fp-IRS1,肝=21.835，P<0.01；Fp-IRS1,HepG2=38.230，P<0.01)，抑制p-GSK3β磷酸化(Fp-GSK3β,肝=41.575,P<0.01;Fp-GSK3β,HepG2=103.452，P<0.01)(圖7、8)。此外，格列齊特可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4的膜表達(dá)(F=114.411，P<0.01)(圖9)。

3 討論

胰島素抵抗是糖尿病、高血壓和肥胖等疾病的共同發(fā)病機(jī)制之一。目前臨床上用于治療糖尿病的藥物中，具有改善胰島素抵抗的藥物主要包括雙胍類和噻唑烷二酮類。但這兩類藥物由于胃腸道不耐受或繼發(fā)不良反應(yīng)等原因，導(dǎo)致部分患者服用后胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)無(wú)法改善，甚至導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥提早出現(xiàn)[15]，故尋找更多的能夠改善胰島素抵抗的藥物很有必要。格列齊特通過(guò)選擇性作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌的作用以降低血糖，但格列齊特對(duì)T2DM肝臟胰島素抵抗的作用尚不清楚[8]。本研究擬通過(guò)構(gòu)建T2DM小鼠模型和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型來(lái)探究格列齊特對(duì)肝臟胰島素抵抗的作用及其可能的分子機(jī)制。

T2DM小鼠模型的給藥結(jié)果顯示，格列齊特可以降低T2DM小鼠空腹血糖，改善糖耐量，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力；促進(jìn)胰島素分泌，改善T2DM小鼠對(duì)胰島素敏感性。同時(shí)格列齊特可以改善T2DM小鼠的肝臟損傷，肝臟空泡化和肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加完整，排列整齊，核質(zhì)清晰，邊界清楚。此外，格列齊特還可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和糖原含量。這提示格列齊特能夠改善T2DM小鼠肝臟胰島素抵抗，促進(jìn)葡萄糖代謝和糖原合成。

圖8 格列齊特調(diào)節(jié)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路(n=3)

圖9 格列齊特對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4膜表達(dá)的影響(n=3)

前期研究發(fā)現(xiàn)，格列齊特可能通過(guò)促進(jìn)InsR磷酸化提高胰島素抵抗C2C12細(xì)胞的胰島素敏感性；通過(guò)促進(jìn)GLUT4膜易位改善過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，這提示格列齊特可能通過(guò)恢復(fù)胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)改善體內(nèi)各組織胰島素抵抗的水平[9-10]。但格列齊特對(duì)肝臟胰島素信號(hào)通路的調(diào)控作用尚不清楚，故為了進(jìn)一步探究格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了格列齊特對(duì)T2DM小鼠肝組織和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果表明，格列齊特可以增加T2DM小鼠肝臟和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞InsR和PI3K表達(dá)，促進(jìn)IRS1磷酸化，抑制GSK3β磷酸化。同時(shí)，格列齊特還可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4膜表達(dá)。因此，格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的分子機(jī)制可能與上調(diào)胰島素信號(hào)通路有關(guān)。

在本研究當(dāng)中我們用高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠4周后腹腔注射STZ誘導(dǎo)T2DM動(dòng)物模型，該模型造模成功率高，重復(fù)性好，且成本較低，能夠很好的滿足我們對(duì)實(shí)驗(yàn)的要求。但該模型仍存在造模時(shí)間長(zhǎng)，只能模仿糖尿病的某一方面或某些方面特點(diǎn)的局限性，故我們下一步將采用db/db小鼠觀察格列齊特的治療作用。此外，在本研究中，我們只探討了格列齊特對(duì)胰島素信號(hào)通路InsR、IRS1和PI3K的影響，胰島素信號(hào)通路中其他關(guān)鍵組分有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，格列齊特可以顯著改善T2DM小鼠肝臟胰島素抵抗的糖代謝和肝損傷，增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和糖原合成，其機(jī)制可能與上調(diào)胰島素信號(hào)通路有關(guān)。