張 之，胡海洋，葛 尤，盧 靜，周 瑩，徐曉琴，邱 濤，傅更鋒

0 引 言

艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是一個系統(tǒng)性疾病，表現(xiàn)為CD4+T淋巴細胞進行性降低，其他淋巴細胞亞群亦存在不同程度的異常。部分HIV感染者在不經(jīng)過抗病毒治療的前提下，依然能夠在5年以上的時間維持較高的CD4+T細胞計數(shù)和較低的病毒載量(<2000 copies/mL)，這類人群被稱為HIV血漿控制者[1-2]。血漿控制者為研究機體抗HIV的免疫機制提供了模型，已成為世界艾滋病研究領(lǐng)域的熱點之一。早期研究將血漿控制者抗HIV 的機制歸因于缺陷病毒的感染[3-4]或宿主趨化因子受體多態(tài)性(如CCR5-Δ32、CCR2-64I等)[5-6]，但是后來研究發(fā)現(xiàn)血漿控制者中具有完全復(fù)制能力的病毒株[7]，并且宿主趨化因子受體多態(tài)性在不同的人種中也存在著分布不均。上述結(jié)果表明病毒基因突變和宿主基因多態(tài)性無法完全解釋這一現(xiàn)象，宿主免疫系統(tǒng)可能也是血漿控制者抗HIV感染的重要原因之一[8]。

因此，了解血漿控制者體內(nèi)免疫狀況，對揭示其免疫防御機制具有重要意義。但由于血漿控制者樣本獲得的稀缺性，目前對血漿控制者機體免疫機制的研究仍然較少。有效清除病毒感染細胞需要先天免疫效應(yīng)和適應(yīng)性免疫效應(yīng)的連續(xù)活動，這可能與淋巴細胞各亞群均有關(guān)聯(lián)[8]。本研究旨在通過對血漿控制者、慢性感染者以及健康人群外周血淋巴亞群的表達情況進行分析和比較，為進一步研究血漿控制者免疫作用機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集江蘇省內(nèi)艾滋病防治基本信息系統(tǒng)2016年1月至2018年12月29例HIV-1抗體陽性患者。根據(jù)患者CD4細胞計數(shù)和病毒載量水平分為：血漿控制組[病毒載量≤2000 copies/mL，平均病毒載量(991±887)copies/mL,n=6]、慢性感染組[病毒載量≥2000 copies/mL, 平均病毒載量(52 181±10 180)copies/mL,n=23]，另選取健康人群為對照組(n=70)。6例血漿控制者中3例B亞型，2例BC亞型，1例AE亞型；23例慢性感染者中3例B亞型，14例BC亞型，6例AE亞型。納入標(biāo)準(zhǔn)： HIV-1抗體確證陽性≥5年，且未經(jīng)治療的HIV感染者。排除標(biāo)準(zhǔn)：機會性感染等嚴(yán)重合并癥；CCR5△32缺失者。本研究經(jīng)過江蘇省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：JSJK-B005-02)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 儀器和試劑FACS Calibur流式細胞分析儀及配套CD4+T淋巴細胞、NK/B細胞絕對計數(shù)熒光抗體試劑購自美國BD公司， Abbott m2000rt熒光定量PCR儀購自雅培公司，配套核酸試劑。

1.2.2實驗室檢測采集HIV感染者和健康對照靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，24 h內(nèi)完成T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞的絕對計數(shù)的流式檢測，剩余血樣當(dāng)天離心收集血漿-80 ℃保存，30 d內(nèi)完成HIV病毒載量檢測。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況3組年齡、性別和傳播途徑分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表 1 入組研究對象的基本情況

2.2淋巴細胞亞群絕對計數(shù)水平的比較血漿控制組、慢性感染組CD4+T 、CD8+T計數(shù)明顯低于健康對照組(P<0.05)，血漿控制組CD4+T計數(shù)明顯高于慢性感染者組(P<0.05)，血漿控制組與慢性感染組CD8計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。慢性感染組NK細胞計數(shù)、CD4/CD8比值明顯低于健康對照組(P<0.05)。血漿控制組與健康對照組B細胞計數(shù)、CD4/CD8比值明顯高于慢性感染組(P<0.05)。見表2。

表 2 血漿控制者、慢性感染者與健康對照者外周血淋巴細胞亞群計數(shù)的比較

2.43組間淋巴細胞亞群之間的相關(guān)性血漿控制組外周血CD4+、B和NK細胞計數(shù)之間兩兩呈正相關(guān)(P<0.05)；慢性感染組NK與CD4+、B細胞呈正相關(guān)(P<0.05)；而健康對照組僅B細胞與CD4+呈正相關(guān)(P<0.05)；慢性感染組和健康對照組中CD8+與CD4+細胞呈弱正相關(guān)(P<0.05)。血漿控制組各亞群之間的r值高于慢性感染組和健康對照組。見表3，圖1。

表 3 血漿控制者、慢性感染者和健康對照外周血淋巴細胞亞群相關(guān)系數(shù)

a、b、c:血漿控制組； d、e、f：慢性感染組； g、h：健康對照組

3 討 論

淋巴細胞亞群通過發(fā)揮不同功能，在人體免疫功能調(diào)節(jié)中起到免疫監(jiān)視效果，并發(fā)揮著重要作用，機體免疫狀況可以通過淋巴細胞亞群分布反映出來[9-10]。其各亞群之間的平衡狀態(tài)與機體的免疫功能密切相關(guān)。在未經(jīng)治療的HIV感染者中，其體內(nèi)的病毒不斷復(fù)制，會引起所有主要淋巴細胞群的紊亂，包括B細胞、NK細胞、CD4+和CD8+細胞[11-13]，導(dǎo)致異常的免疫激活。

T淋巴細胞有輔助、殺傷和抑制功能。本研究中，慢性感染者的T淋巴細胞亞群的變化與其他研究結(jié)論高度一致[18]，CD4+T淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞升高，符合HIV感染的一般進程表現(xiàn)。而血漿控制者組雖然也有類似結(jié)果，但CD4+T淋巴細胞水平卻明顯高于慢性感染者，表明CD4+T淋巴細胞的受損程度低于慢性感染者。這可能與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)表達相對降低有關(guān)[20]，也有可能與CAF (CD8+cell antiviral factor)介導(dǎo)CD8+T細胞的非細胞毒性抗病毒反應(yīng)有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)血漿控制者CD4+/CD8+比值低于健康對照但高于慢性感染者，這說明3組間免疫激活程度不同，血漿控制者的免疫激動狀態(tài)與慢性感染者存在一定差異。此外，有研究表明，具有控制病毒能力的 CD8+CD28+T淋巴細胞的水平在HIV 潛伏感染緩慢降低，雖然 CD8+T 細胞數(shù)量仍然高于正常，但其功能卻進一步下降[22-23]，這提示我們可以進一步對血漿控制者外周血中CD8+、CD28+T淋巴細胞水平進行研究，探索其升高的CD8+T細胞控制病毒的能力以及對CD4+T細胞的調(diào)節(jié)功能。另外，T細胞活化水平越高,其凋亡速度也越快[22]，導(dǎo)致 T淋巴細胞的高易感性和易耗竭[24]，血漿控制者T細胞活化程度也值得進一步探索。

B細胞和NK細胞分別是體液免疫和固有免疫的效應(yīng)細胞。有研究顯示在HIV感染中，B細胞的總頻率降低，而凋亡誘導(dǎo)的B細胞死亡增加是HIV感染過程中B細胞減少的重要原因[15]。B細胞通過抗原提呈、分泌細胞因子和抗體等功能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[25]。本研究中慢性感染者B細胞數(shù)量低于健康人群，而血漿控制者B細胞總數(shù)和健康人群無異，且高于慢性感染者，提示血漿控制者B細胞數(shù)量并未受損，可能并未出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象，但是其亞群和功能是否受損，需要進一步的實驗驗證。HIV感染后，NK細胞也受到一定程度的破壞，其數(shù)量和亞群均受到影響。NK細胞是機體防御病毒和腫瘤的天然屏障，它能分泌細胞毒因子和顆粒酶穿孔素而殺傷被感染的靶細胞[13]。本研究結(jié)果中慢性感染者NK細胞數(shù)量低于健康人群，而血漿控制者NK細胞水平則與健康人群無異，表明血漿控制者NK細胞的功能受損程度低于慢性感染者。

本研究血漿控制者中，CD4+細胞、B細胞和NK細胞之間呈現(xiàn)高度的正相關(guān)性，在慢性感染者和健康對照中其相關(guān)性或有或弱，提示血漿控制者淋巴細胞亞群之間可能存在積極的相互促進關(guān)系。有研究表明，B細胞與CD4+T淋巴細胞存在穩(wěn)態(tài)效應(yīng)[26]，CD4+T細胞代表T輔助細胞亞群(Th)，具有輔助B細胞及誘導(dǎo)其他細胞亞群的活化的作用，在免疫調(diào)節(jié)中，對細胞免疫和體液免疫平衡的維持具有樞紐的功能，而 B細胞作為APC也可給CD4+T細胞提供活化和共刺激信號[27]。有學(xué)者提出，HIV感染病毒血癥者B細胞輔助T細胞活化和增殖的能力比健康人和無病毒血癥者更低，而CD4+T細胞活化后通過CD40L輔助B細胞增殖的能力受損[28]。而本次研究結(jié)果則間接支持了這一研究結(jié)論，健康人群中，CD4+T細胞與B細胞存在一定的正相關(guān)；在慢性感染者中，CD4+T細胞活化增殖能力降低，不能有效刺激B細胞增殖，與B細胞計數(shù)相關(guān)性消失，但是，在血漿控制者中，CD4+T細胞與B細胞高度正相關(guān)，意味著CD4+T細胞輔助B細胞增殖的能力比健康人群要強。但是這一推論仍需通過進一步實驗研究去驗證。血漿控制者中NK細胞與CD4+T細胞、B細胞之間的相互作用機制尚不明確，本研究為觀察性研究，不同研究對象的淋巴細胞亞群改變與疾病進程之間的關(guān)系只能得出存在相關(guān)性的結(jié)論，尚無法推論出因果關(guān)系，值得更進一步的探索。

目前所有的治療方法尚無法徹底清除所有病毒，只能達到功能性治愈，即將病毒載量水平抑制在極低的水平。深入了解血漿控制者各淋巴亞群的功能情況及相互作用機制，或?qū)⒛軌蛱剿鞲鼉?yōu)化的先天免疫效應(yīng)和適應(yīng)性免疫效應(yīng)的免疫應(yīng)答模式，為艾滋病的免疫功能治療提供新的思路。