蘭 天，姚 輝

0 引 言

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥是最常見的常染色體隱性遺傳病之一，由CYP21A2基因突變所致的21-羥化酶缺乏癥(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)占先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的90%～95%。中國的發(fā)病率為1∶12 200～1∶16 466[1]。21-OHD臨床分型為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。經(jīng)典型又可進(jìn)一步分為單純男性化型和失鹽型。多項(xiàng)研究表明，CYP21A2基因型與21-OHD表型之間存在相關(guān)性[2-5]，但不同種族間CYP21A2基因的突變頻率差異較大[6-8]。隨著21-OHD的新生兒篩查逐漸普及，近幾年該病的診治模式發(fā)生了變化，越來越多的患兒通過新生兒篩查被檢出?；純捍_診時(shí)往往缺乏典型的臨床表現(xiàn)而易誤診。新生兒篩查檢出的21-OHD患者缺乏精確的臨床分型，治療時(shí)藥物的種類和劑量也更難把握。本研究旨在探討湖北地區(qū)經(jīng)典型21-OHD患兒基因型與臨床分型關(guān)系，通過基因型預(yù)測臨床分型，為新生兒篩查陽性患兒的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2010年8月至2019年3月武漢兒童醫(yī)院遺傳代謝內(nèi)分泌科64例確診并入組的經(jīng)典型21-OHD的患者臨床資料。其中男38例，女26例，年齡7天～6.9歲(平均年齡1.4個(gè)月)。納入標(biāo)準(zhǔn)：參考2016年《先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥21-羥化酶缺陷診治共識》[1]；均為漢族，祖籍湖北。排除標(biāo)準(zhǔn)：由新生兒篩查陽性診斷的21-OHD，其他類型的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥，如3β-羥化酶缺乏癥等。本研究獲得武漢兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：武兒醫(yī)2017020)，患兒父母均簽署了知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 資料收集記錄經(jīng)典型21-OHD患者的具體臨床分型(失鹽型、單純男性化型)、基因檢測結(jié)果，包括CYP21A2基因型、突變位點(diǎn)等。

1.2.2臨床分型失鹽型：出現(xiàn)惡心、嘔吐、喂養(yǎng)困難、脫水、體重增長緩慢，伴有低血壓、低鈉高鉀血癥、17-羥孕酮水平升高、血漿腎素活性增加、皮質(zhì)醇和醛固酮降低。單純男性化型：女性外生殖器異常(陰蒂增大似陰莖、陰唇融合等)、男童性陰莖增大(但睪丸不增大)、陰毛早現(xiàn)、血清17-羥孕酮水平升高、身高增長速率過快、骨齡超前，早期身高高于同齡兒，隨著骨骼的成熟最終導(dǎo)致身材矮小[1]。

1.2.3基因檢測二代測序聯(lián)合多重鏈接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(multiple linked probe amplification，MLPA)，外送金準(zhǔn)基因檢測公司。

1.2.4基因型分組根據(jù)21-羥化酶受損的嚴(yán)重程度，將突變從重到輕分為極重度突變組(n=15)、重度突變組(n=23)、中度突變組(n=23)、未知突變組(n=3)。極重度突變組包括Del、p.G110fs、Cluster6E (p.I236N、p.V238E、p.M240K)、p.Q319X、 p.R357W、p.484P的任意組合，可導(dǎo)致21-羥化酶活性完全喪失。重度突變組包括I2G的純合突變、I2G與極重度突變組組成的復(fù)合雜合突變，會導(dǎo)致21-羥化酶活性小于正常的1%。中度突變組包括p.I173N的純合突變、p.I173N與重度突變組、極重度突變組組成的復(fù)合雜合突變，21-羥化酶活性為正常酶活性的2%。未知突變組包含有罕見突變位點(diǎn)的純合突變或復(fù)合雜合突變。由于未知突變組突變引起的21-羥化酶活性改變未知，因此不納入基因型預(yù)測臨床表型研究范圍內(nèi)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示，組間比較采用Fisher確切概率法。Spearman秩相關(guān)分析判斷疾病的嚴(yán)重程度(失鹽型、單純男性化型)與基因型分組的關(guān)系。以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CYP21A2基因型64例患兒中，76.6%為復(fù)合雜合突變，23.4%為純合突變。11例患兒存在3處突變。臨床分型中，失鹽型40例(62.5%)，單純男性化型24例(37.5%)，見表1。

表 1 經(jīng)典型21-OHD患兒基因檢測結(jié)果(n)

2.2突變頻率分布64例患兒共檢出139處突變，包括10種不同的突變，無新發(fā)突變位點(diǎn)檢出。總體突變頻率較高的為I2G、p.I173N、Del等。其中大片段缺失占20.9%，微轉(zhuǎn)換占77.7%。失鹽型、單純男性化型基因突變頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。失鹽型最常見的突變位點(diǎn)為I2G(39.8%)、Del(25.0%)、p.R357W(15.9%)、p.Q319X(8.0%)。單純男性化型最常見的突變位點(diǎn)為p.I173N(51.0%)、Del(13.7%)、I2G(9.8%)、p.R484P(9.8%)。見表2。

表 2 經(jīng)典型21-OHD患兒總體突變頻率的分布情況

2.3基因型與臨床分型關(guān)系總體基因型預(yù)測臨床分型準(zhǔn)確率為91.8%。極重度突變組對失鹽型的陽性預(yù)測率為86.7%(13/15)，重度突變組對失鹽型的陽性預(yù)測率為100%(22/22)，中度突變組對單純男性化型的陽性預(yù)測率為 87.0%(20/23)。極重度突變組、重度突變組、中度突變組基因型與經(jīng)典型21-OHD臨床分型存在顯著正相關(guān)(rs=0.691，P=0.00)。說明基因型可以很好地預(yù)測21-OHD臨床分型?；蛐蜑闃O重度和重度突變組的患兒更傾向于較嚴(yán)重的失鹽型，基因型為中度突變組的患兒傾向于嚴(yán)重程度較輕的單純男性化型。結(jié)果顯示，單純男性化型患兒占比隨基因突變對應(yīng)的殘留21-OHD活性增加而逐漸增多。見圖1。

圖 1 經(jīng)典型21-OHD患兒基因型-表型關(guān)系

3 討 論

CYP21A2基因位于6號染色體短臂(6p21.31)，在重組活性很高的主要組織相容性復(fù)合體III區(qū)域內(nèi)[11]。該區(qū)域組成復(fù)雜，基因在大小和拷貝數(shù)上存在很大變異[12-13]。由于CYP21A2基因結(jié)構(gòu)的特殊性，推薦先使用MLPA檢測基因缺失，再通過二代測序檢測點(diǎn)突變[14-16]。本研究共檢出10種不同的突變，最常見的3種為I2G、p.I173N、Del。

目前報(bào)道與21-OHD有關(guān)的突變有1300多種，其中有230種會影響人類健康[6]。230種致病突變中156種會導(dǎo)致經(jīng)典型，74種會導(dǎo)致NC 21-OHD[6]。其中有10種突變最為常見，可以幫助解決大多數(shù)臨床問題。包括大片段的基因缺失和轉(zhuǎn)換、 8種CYP21A2與CYP21A2P來源的點(diǎn)突變(p.P30L、I2G、p.I173N、E6 cluster、p.V281L、F306+T、p.Q318X、p.R357W)、外顯子3的p.G110fs(8個(gè)堿基對丟失)。這10種突變占所有突變的絕大多數(shù)，本組91.3%的基因突變在此范圍內(nèi)。本研究患兒失鹽型占62.5%；單純男性化型占37.5%，與文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]基本一致。

本研究湖北地區(qū)64例患兒中，21-OHD兒童的基因型-表型一致性高，重度突變組患者的臨床表型與預(yù)期表型的一致性達(dá)100%，高于其他大型研究中報(bào)告的陽性預(yù)測值76%～96%[4,18-19]。但極重度突變組有2例表現(xiàn)為單純男性化型，基因型分別為p.R357W/p.R484P、p.R357W/p.V238E/p.M240K。p.R357W理論上與失鹽型相關(guān)。動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，p.R357W突變會嚴(yán)重破壞21-羥化酶的活性[20]。p.R484P理論上也與失鹽型相關(guān)。外顯子10上兩個(gè)GG堿基被C堿基對取代，終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致21-羥化酶完全失活。本研究4例中僅1例表現(xiàn)為單純男性化型，可能與部分患者產(chǎn)生少量具有活性的21-羥化酶有關(guān)[19]。外顯子6的Cluster 6E三種錯(cuò)義突變(p.I236N、p.V238E、p.M240K)常同時(shí)存在。這種2種或3種突變的串聯(lián)出現(xiàn)會使21-羥化酶失去G螺旋結(jié)構(gòu)，干擾了酶與底物的結(jié)合，使21-羥化酶完全不能發(fā)揮其應(yīng)有的催化效應(yīng)。p.I236N、p.V238E、 p.M240K的單獨(dú)突變對21-羥化酶活性不會產(chǎn)生大的影響[21]。中度突變組預(yù)測表型為單純男性化型，但有3例表現(xiàn)為失鹽型，基因型分別為p.I173N/p.I173N、p.I173N/p.R484P、p.R357W/p.I173N。可能與21-羥化酶在轉(zhuǎn)錄、調(diào)控、翻譯中的細(xì)微變化有關(guān)[21]。本研究4例未知突變組均攜帶p.S494N突變，2例失鹽型和2例單純男性化型。該變異的臨床意義尚不明確[22]。有研究曾報(bào)道1例p.S494N純合突變的女性患者診斷為失鹽型[23]。

近年來，21-OHD的診療模式逐漸變化。21-OHD的新生兒篩查在我國各地區(qū)逐漸普及。新生兒篩查可檢出17-羥孕酮升高的患者。但僅通過激素檢測不能預(yù)知患兒的疾病的嚴(yán)重程度、確定具體的臨床分型[24]。較嚴(yán)重的失鹽型與癥狀較輕的單純男性化型用藥的種類和劑量不同。本研究建立湖北地區(qū)21-OHD的基因型與臨床表型的對應(yīng)關(guān)系，可為臨床醫(yī)生提供基因型-表型框架?；純旱幕蚍纸M為極重度或重度突變組時(shí)，主要考慮失鹽型；中度突變組需主要考慮單純男性化型?；蛐团c臨床表型的特定關(guān)系可直接服務(wù)于臨床診斷，為新生兒篩查陽性患兒臨床分型提供依據(jù)，以實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的治療。但基因型預(yù)測也存在少量不確定因素，需要結(jié)合臨床體征、生化檢測以及診療過程的密切隨訪來彌補(bǔ)。

21-OHD基因型-臨床表型對應(yīng)關(guān)系，可指導(dǎo)氫化可的松用藥劑量、縮短到達(dá)維持劑量需要的時(shí)間、降低對患兒成年后身高的影響、盡可能避免外周性性早熟和雄激素過多綜合征的發(fā)生。女性外生殖器男性化的患兒也可及時(shí)找出病因[25]并及時(shí)治療。基因型預(yù)測為失鹽型的患兒，推薦使用氫化可的松聯(lián)合氟氫可的松。這種精準(zhǔn)的治療方案可最大程度避免腎上腺危象、減少高鉀低鈉血癥發(fā)生、減少住院次數(shù)、縮短住院時(shí)間?；蛐皖A(yù)測為單純男性化型的患兒，可避免使用過量的氟氫可的松。降低單純男性化型患兒發(fā)生醫(yī)源性高血壓風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，湖北地區(qū)兒童經(jīng)典型21-OHD基因型預(yù)測疾病臨床表型可靠性高?；颊呋蛐蜑闃O重度或重度突變組時(shí)，主要考慮失鹽型；基因型為中度突變組時(shí)，主要考慮單純男性化型。本研究21-OHD基因型-表型對應(yīng)關(guān)系，為湖北地區(qū)新生兒篩查陽性患兒提供了診斷和治療依據(jù)。