高炟鵬，周志強(qiáng)，張利東，嵇 晴

0 引 言

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是手術(shù)麻醉后一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為認(rèn)知記憶能力受損、注意力和社交能力下降，可持續(xù)數(shù)周到數(shù)月，尤多見于老年患者[1]。研究報(bào)道，60歲以上老年人非心臟手術(shù)的POCD發(fā)生率在術(shù)后3個(gè)月高達(dá)10%[2]。POCD可導(dǎo)致患者術(shù)后恢復(fù)延遲、生活自理能力下降、術(shù)后并發(fā)癥增加甚至增加患者死亡率，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]。然而，POCD的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[4-6]。本研究探討神經(jīng)振蕩活性變化在神經(jīng)炎癥介導(dǎo)POCD中的作用，為其防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組老年雄性C57BL/6小鼠48只(18～20月齡，26～35 g)，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號[SCXK(魯)20160001]，飼養(yǎng)于濕度45%，溫度25 ℃，12 h燈照(07:00-19:00)的動物房中，自由攝水，飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、手術(shù)組、手術(shù)+米諾環(huán)素組，每組16只。其中，對照組：不接受麻醉與手術(shù)；手術(shù)組：僅接受手術(shù)；手術(shù)+米諾環(huán)素組：接受麻醉與手術(shù)，并術(shù)畢即腹腔注射米諾環(huán)素(40 mg/kg)，術(shù)后第2、3天每日注射1次，連續(xù)3d[7]。每組隨機(jī)取11只小鼠做行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，另外5只做電生理檢測；11只動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后隨機(jī)選擇其中6只取海馬組織檢測海馬炎癥因子。

1.2POCD動物模型建立采用七氟醚麻醉+剖腹探查建立POCD動物模型[8]。小鼠先暴露于2.1%七氟醚+100% O2的麻醉室中30 min后立即進(jìn)行手術(shù)，術(shù)中繼續(xù)給予2.1%七氟烷麻醉維持。在腹部正中剪開約1 cm切口，然后對器官、腸和肌肉組織進(jìn)行探查。探查完畢采用無菌4-0鉻腸線縫合肌肉筋膜和皮膚。術(shù)后在傷口涂抹聚卟啉(美國輝瑞公司)以防止感染。對照組小鼠未接受麻醉與手術(shù)。

1.3曠場實(shí)驗(yàn)曠場實(shí)驗(yàn)用于評估小鼠的探索行為和焦慮行為。將小鼠置于40 cm×40 cm×40 cm的敞箱中心，自由探索5 min。記錄并分析中央格停留時(shí)間和活動總距離(中國上海欣軟信息技術(shù)有限公司)。每次實(shí)驗(yàn)之前，用75%乙醇擦拭敞箱以免氣味干擾。

1.4新物體識別實(shí)驗(yàn)新物體識別實(shí)驗(yàn)用于評估小鼠認(rèn)知能力。在一個(gè)40 cm×60 cm×50 cm的敞箱中進(jìn)行。第1天為適應(yīng)，將小鼠放在敞箱中自由探索5 min。第2天，將兩個(gè)相同的物體放在敞箱中對稱的位置，讓小鼠自由探索10 min。第3天，將其中一個(gè)物體換成顏色和形狀完全不同的新物體，繼續(xù)讓小鼠自由探索10 min，使用視頻跟蹤系統(tǒng)記錄。對物體的探索定義為動物的鼻子位于距離≤2 cm的區(qū)域內(nèi)。新物體探索率按以下計(jì)算公式：

探索率(%)=新物體探索時(shí)間/(新物體探索時(shí)間+熟悉物體探索時(shí)間)×100%

1.5條件恐懼實(shí)驗(yàn)條件恐懼實(shí)驗(yàn)用于評估小鼠聯(lián)想記憶。實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和測試兩部分。把小鼠單獨(dú)放在實(shí)驗(yàn)箱中自由探索180 s，然后給予30 s的聲音刺激(70 dB，3000 Hz)，在聲音刺激的最后2 s給予足底電擊(0.75 mA)。適應(yīng)30 s后放回原來的籠子里。訓(xùn)練結(jié)束后24 h，進(jìn)行場景性條件恐懼測試(海馬依賴性測試)。將小鼠放到原來的試驗(yàn)箱，不給予任何刺激，監(jiān)測5 min內(nèi)的僵直時(shí)間。2 h后，在一個(gè)改變環(huán)境及氣味的試驗(yàn)箱內(nèi)進(jìn)行聲音關(guān)聯(lián)性條件恐懼測試(海馬獨(dú)立性測試)。小鼠在實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)3 min之后給予連續(xù)3 min與訓(xùn)練時(shí)相同的聲音刺激，并記錄后3 min內(nèi)的僵直時(shí)間。僵直行為是指除了呼吸以外沒有任何運(yùn)動。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法腹腔注射2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)處死小鼠，收集海馬，在每100 mg腦組織中加入1 mL 冰等滲鹽水研磨使組織變成勻漿。以10 000×g轉(zhuǎn)速低溫離心10 min分離血漿。根據(jù)說明書，用ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(貨號ab208348)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(貨號ab197742)、IL-6(貨號ab100712)和IL-10(貨號ab108870)的水平(Abcam，中國)。所有樣品均進(jìn)行了重復(fù)分析，讀數(shù)均與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的含量標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7場電位記錄戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，并用0.5%布比卡因局部浸潤麻醉鎮(zhèn)痛。將動物固定于腦立體定位儀，眼睛涂上眼部潤滑劑。切開皮膚，暴露頂部頭骨，使中線和前囟可見。根據(jù)小鼠腦圖譜，標(biāo)記海馬CA1區(qū)電極插入位置(向后 2.1 mm; 側(cè)方1.5～1.7 mm; 深度1.7～2.1 mm)，本研究使用特制模具制作成可植入海馬CA1區(qū)的4通道微絲陣列電極。用牙科水泥將所有電極絕緣并固定于顱骨表面，縫合頭皮。術(shù)后3 d給予小鼠腹腔注射青霉素抗感染，單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)1周。局部場電位采集由Plexon公司(Plexon，Dallas，Tx)生產(chǎn)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)完成，采樣頻率分別為40 kHz和1 kHz，并給予50 Hz干擾排除。

2 結(jié) 果

2.1曠場實(shí)驗(yàn)與對照組比較，手術(shù)組小鼠新物體探索時(shí)間、辨別指數(shù)與場景關(guān)聯(lián)僵直時(shí)間均顯著降低(P<0.05)。與手術(shù)組比較，手術(shù)+米諾環(huán)素組新物體探索時(shí)間、辨別指數(shù)與場景關(guān)聯(lián)僵直時(shí)間均顯著增加(P<0.05)。各組小鼠在探索總路程、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間與聲音關(guān)聯(lián)僵直時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2小鼠海馬炎癥介質(zhì)的比較與對照組比較，手術(shù)組小鼠海馬IL-1β與IL-6水平顯著增高(P<0.05)。與手術(shù)組比較，手術(shù)+米諾環(huán)素組IL-1β與IL-6水平顯著降低(P<0.05)。各組小鼠海馬TNF-α與IL-10表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3不同環(huán)境下場電位比較與對照組比較，手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)γ振蕩均顯著降低(P<0.05)。與手術(shù)組比較，手術(shù)+米諾環(huán)素組海馬CA1區(qū)γ振蕩顯著增加(P<0.05)。在場景關(guān)聯(lián)環(huán)境中：與對照組比較，手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)γ振蕩均顯著降低(P<0.05)。與手術(shù)組比較，手術(shù)+米諾環(huán)素組海馬CA1區(qū)γ振蕩顯著增加(P<0.05)。見圖1。

表 1 小鼠行為學(xué)的比較

與對照組比較，*P<0.05;與手術(shù)組比較，#P<0.05

表 2 小鼠海馬炎性介質(zhì)的比較

與對照組比較，*P<0.05;與手術(shù)組比較，#P<0.05

a:靜息狀態(tài)； b:新物體識別實(shí)驗(yàn)； c:場景相關(guān)性環(huán)境

3 討 論

隨著全球人口老齡化加劇，接受手術(shù)的老年患者越來越多，POCD的防治也越發(fā)迫切[9]。本研究結(jié)果顯示：POCD小鼠海馬炎癥反應(yīng)增加，γ振蕩缺失，而應(yīng)用米諾環(huán)素可以逆轉(zhuǎn)過度炎癥反應(yīng)與γ振蕩缺失，從而改善POCD。因而，本研究推測神經(jīng)炎癥介導(dǎo)海馬γ振蕩異常很可能在POCD中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能為POCD的防治提供新的靶標(biāo)。

POCD是繼發(fā)于手術(shù)后的認(rèn)知功能改變。流行病學(xué)顯示POCD與遺傳、高齡、術(shù)前認(rèn)知狀態(tài)、術(shù)前合并癥、術(shù)前用藥、外科手術(shù)和麻醉藥物等有關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡述[2]。國內(nèi)外最新研究均表明：POCD的發(fā)生可能是多途徑的，與Aβ聚集及Tau蛋白過度磷酸化、中樞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)失衡及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞改變等有關(guān)[9]。其中，中樞免疫系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是POCD發(fā)生的關(guān)鍵因素。手術(shù)創(chuàng)傷可誘導(dǎo)活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6[10]，后者引起突觸結(jié)構(gòu)功能改變和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受損。本研究也顯示：在剖腹探查建立的POCD動物模型中，海馬IL-1β與IL-6表達(dá)顯著增加，而米諾環(huán)素可以降低IL-1β與IL-6水平并改善小鼠認(rèn)知功能。我們的研究結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，提示中樞炎癥在POCD中發(fā)揮非常重要的作用[4-6]。然而，中樞炎癥是通過何種機(jī)制介導(dǎo)POCD的發(fā)生仍有待進(jìn)一步研究。

學(xué)習(xí)記憶等基本的大腦活動有賴于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)正常有效地活動。越來越多的證據(jù)表明：γ振蕩是神經(jīng)微環(huán)路的一種基本形態(tài)且普遍存在于動物和人類皮層、海馬以及丘腦等多個(gè)大腦區(qū)域[11]。γ振蕩能夠?qū)植颗d奮性錐體神經(jīng)元提供同步抑制性突觸后電位，抑制其節(jié)律，并可由快速興奮的錐體神經(jīng)元反饋調(diào)節(jié)和穩(wěn)定，從而在多種高級腦功能活動中如學(xué)習(xí)記憶等發(fā)揮重要作用[12]。在雙相情感障礙的抑郁癥患者中，γ振蕩出現(xiàn)明顯下降[13]。在有記憶損害的阿爾茲海默病患者的腦電圖中，其自發(fā)的γ振蕩及在圖片刺激條件下引發(fā)的γ振蕩均明顯降低[14]。這些結(jié)果提示γ振蕩異常很可能介導(dǎo)POCD的發(fā)生。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)盡管在靜息狀態(tài)下各組動物在各個(gè)頻段振蕩無差異，但在執(zhí)行認(rèn)知活動如新事物識別與場景恐懼實(shí)驗(yàn)時(shí)，手術(shù)組動物出現(xiàn)γ振蕩受損，而米諾環(huán)素可逆轉(zhuǎn)γ振蕩異常，并改善認(rèn)知功能。這些結(jié)果提示中樞炎癥介導(dǎo)的γ振蕩異常在POCD中發(fā)揮重要作用。不僅如此，新近文獻(xiàn)指出，通過興奮PV中間神經(jīng)元誘發(fā)的γ振蕩能減少阿爾茲海默病動物模型腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生，從而改善認(rèn)知功能[15]。

本研究存在不足之處:①我們未使用特異性增強(qiáng)γ振蕩的技術(shù)，因此本研究未能建立γ振蕩與認(rèn)知功能的因果關(guān)系；②鑒于本研究樣本量相對較小，研究結(jié)果需要更多的研究證實(shí)與驗(yàn)證。

總之，本研究結(jié)果顯示，神經(jīng)炎癥介導(dǎo)海馬γ振蕩異常很可能在POCD中發(fā)揮關(guān)鍵作用，鑒于γ振蕩在認(rèn)知功能執(zhí)行中的重要作用，對其進(jìn)行有效干預(yù)有望成為相關(guān)疾病如POCD的防治新方法。