郭瑞峰 ，李雪梅 ，劉少偉 ，姚剛

( 1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237；2．中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所食品安全研究中心，上海200031；3.上海健康醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院上海201318)

0 引 言

牛初乳是健康母牛分娩后7 天內(nèi)特別是3 天內(nèi)分泌的淡黃色乳汁，黏稠度大，且有特殊的苦味[1]。因富含優(yōu)質(zhì)蛋白、脂肪、維生素和礦物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值往往高出常乳幾倍到幾十倍；并且含有大量免疫因子、生長因子等活性功能成分，因此能增加機(jī)體免疫力從而更加有效的抵抗病菌感染，并增強(qiáng)機(jī)體抵抗外界環(huán)境應(yīng)激的能力[2]。牛初乳中的免疫因子主要包括乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、溶菌酶以及免疫球蛋白，這些因子也稱為抗菌因子[3-4]，因此在抗生素沒有問世前，很多國家或是地區(qū)都把牛初乳作為抗病食物食用。19 世紀(jì)50 年代，牛初乳制品(免疫乳)曾被用于治療疾病，20 世紀(jì)70 年代，大量的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明牛初乳的優(yōu)質(zhì)抗病地位，1990 年前后科學(xué)家開始從功能性食品角度關(guān)注牛初乳的開發(fā)問題，整理出大量有關(guān)研究報(bào)告，確認(rèn)了其作為卓越天然抗病食物的地位，并指出牛初乳可直接用于制造免疫及其他功能性的食品[5-7]。此外，牛初乳還含有大量的糖復(fù)合物，從而影響免疫系統(tǒng)的功能[8-9]。然而，目前對(duì)于牛初乳的研究僅限于其中的大分子生物活性物質(zhì)，對(duì)于其中小分子物質(zhì)成分卻鮮有涉及。

葡聚糖凝膠色譜法可以根據(jù)樣品相對(duì)分子質(zhì)量的大小來分離蛋白質(zhì)及多肽分子，反相高效液相色譜法則可將相對(duì)分子量比較接近但是極性不同的蛋白加以分離。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)切向流超濾初步分離得到牛初乳3 ku 以下的蛋白多肽，并通過葡聚糖凝膠色譜法聯(lián)合反相高效液相色譜法進(jìn)一步分離純化，隨后將分離得到的組分進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)并做多肽/蛋白質(zhì)N 端測(cè)序分析，確定了牛初乳中3 ku 以下成分的N 端氨基酸序列，為牛初乳的研究和利用開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

牛初乳由上海奶牛場(chǎng)提供；大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存；無水乙醇、甲醇，上海國藥集團(tuán)；OXOID 牛肉膏；OXOID 胰蛋白胨；Sephadex G-10，G-15，G-25及G-50交聯(lián)葡聚糖凝膠；SY-MU2010切向流超濾系統(tǒng)；ODS-C18 反相高效液相色譜，YMC 公司；HD-4核酸蛋白檢測(cè)儀，上海青浦滬西儀器廠；Thermo 冷凍干燥機(jī)；ZD-85 氣浴恒溫振蕩器，常州金壇良友儀器有限公司；Thermo 酶標(biāo)儀；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化；Thermo低溫離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛初乳的預(yù)處理

牛初乳通過低溫離心脫脂去除上層脂肪，之后利用 2 mol/L HCL 調(diào)節(jié) pH 值至 4.0～5.5，攪拌混勻于45 ℃水浴30 min 后再經(jīng) 8 000 g、4 ℃離心 10 min，去除酪蛋白沉淀，在上清蛋白溶液中根據(jù)牛初乳的體積加入20%的酒精以沉淀白蛋白，再于4 ℃以8 000 g離心20 min，棄去下層的蛋白沉淀后，取出上層清液；之后再利用SY-MU2010 切向流超濾系統(tǒng)對(duì)所得溶液進(jìn)行超濾，在0.06 Pa 壓力下使其依次通過10 ku 和3 ku 超濾膜，從而得到 10 ku 以上、3～10 ku 區(qū)間以及3 ku以下區(qū)段的蛋白。

1.2.2 3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌試驗(yàn)

把收集的不同區(qū)段的蛋白溶液及去除的酪蛋白分別放入茄型瓶中，凍干后收集，稱重，記錄獲得的質(zhì)量數(shù)據(jù)。采用牛初乳中3 ku 以下小分子蛋白片段組份進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

收集到的牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段經(jīng)過冷凍干燥后用液體LB 培養(yǎng)基配制成100 mg/mL 的溶液，再過濾除菌備用。在無雜菌條件下取200 μL 大腸桿菌菌液于10 mL 液態(tài)LB 培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，第二天早上將活化好的菌液取100 μL 加至10 mL 液態(tài)LB 培養(yǎng)基中，震蕩混勻后加入到96 孔板中，每孔滴加100 μL，獲得96 孔板菌懸液。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)置如下：50 mg/mL 組，在菌懸液孔中分別滴加牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段溶液100 μL；25 mg/mL 組，在菌懸液孔中分別滴加牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段溶液50 μL 并添加液態(tài)LB 培養(yǎng)基50 μL；陰性對(duì)照組，在菌懸液孔中分別滴加液態(tài)LB培養(yǎng)基100 μL；陽性對(duì)照組，在菌懸液孔中分別滴加含30 μg/mL 卡那霉素的液態(tài)LB 培養(yǎng)基 100 μL；空白對(duì)照組，在不加菌懸液的空孔中分別滴加不含大腸桿菌的LB 培養(yǎng)基200 μL，所有分組均設(shè)置復(fù)孔并置于37 ℃培養(yǎng)箱中以70 rpm/min 轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)，每隔1 h在酶標(biāo)儀上用600 nm 的波長檢測(cè)一次。

1.2.3 葡聚糖凝膠色譜分離

將預(yù)處理好的葡聚糖凝膠填裝于色譜柱，去離子水沖至柱體積恒定。取3 ku以下牛初乳蛋白片段40 mg，溶解于適量去離子水中，3 mL 上樣，去離子水洗脫，流速為1 mL/min 蒸餾水，依次通過Sephadex G-50、Sephadex G-25、Sephadex G-15、Sephadex G-10 細(xì)分3 ku以下牛初乳蛋白片段，按照峰型收集。

1.2.4 C18反向柱色譜分離3 ku以下小分子蛋白片段

色譜柱用純甲醇灌滿，沖柱至柱體積恒定，用3 倍柱體積10%甲醇溶液平衡柱子。將樣品經(jīng)0.8 μm 微孔濾膜過濾后上樣。用10%甲醇洗脫，流速1 mL/min，連接紫外檢測(cè)儀在線檢測(cè)，檢測(cè)波長為280 nm。

1.2.5 多肽/蛋白質(zhì)N-端測(cè)序分析

將冷凍干燥的牛初乳3 ku 以下小分子蛋白片段經(jīng)由C18 反向柱層析分離收集峰3 的洗脫液，冷凍干燥。把凍干粉末送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心進(jìn)行多肽/蛋白質(zhì)N-端測(cè)序。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 收集從牛初乳中獲得不同區(qū)段的蛋白樣品

每50 mL牛初乳得到樣品質(zhì)量見表1。

表1 50 mL牛初乳得到樣品質(zhì)量

每50 mL 牛初乳經(jīng)過分離凍干后得到樣品總質(zhì)量為4422.87 mg，從表1 可以看出牛初乳中大部分為大分子量蛋白片段，3 Ku以下蛋白片段不足10%。

2.2 牛初乳中3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌試驗(yàn)

圖1 牛初乳中3 ku以下小分子蛋白片段的抑菌試驗(yàn)

通過樣品對(duì)大腸桿菌生長曲線的影響可見牛初乳3 ku 以下區(qū)段蛋白具有顯著的抑菌效果（見圖1），且隨著其濃度的增加其抑菌效果也更佳。

2.3 葡聚糖凝膠色譜分離

圖2 牛初乳蛋白片段的葡聚糖凝膠色譜分離

由上圖可以看出，經(jīng)由Sephadex G-50 和Sephadex G-25 初步確定峰型后利用Sephadex G-15 和G-10 對(duì)3 ku 組分繼續(xù)分離，得到了比較明確的三個(gè)組分（見圖2）。

2.4 反相高效液相色譜法分離

圖3 反相高效液相色譜法分離3 ku以下小分子蛋白片段

表2 反相高效液相色譜法分離3 ku以下小分子蛋白片段所得各峰面積

結(jié)果表明，經(jīng)C18反相高效液相色譜法分離后，3 ku被分離成4 個(gè)部分，按照出峰順序，分別記為1，2，3，4，收集3號(hào)流分并凍干（見圖3和表2）。

2.5 多肽/蛋白質(zhì)N-端測(cè)序報(bào)告

表3 多肽/蛋白質(zhì)N-端測(cè)序報(bào)告

測(cè)序報(bào)告表明所得到的氨基酸序列為NH2-Y-Q-E-P-V-L-G-P-V，該序列經(jīng)與網(wǎng)上相關(guān)報(bào)道(GenBank 序列號(hào)：AAA30431.1)比對(duì)分析為牛乳中的β-酪蛋白上的片段[10]（見表3）。

牛初乳是自然界中的天然食品，既含有豐富的為身體發(fā)育所必需的營養(yǎng)成分，又富含生長因子和免疫因子，對(duì)提高機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)，抗炎抗病毒方面具有很強(qiáng)的功效。其中牛初乳中的大分子蛋白乳鐵蛋白具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌以及抗病毒和抗腫瘤作用，在抵御病原體侵染、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有積極的效果[11]，另外一個(gè)大分子物質(zhì)免疫球蛋白在牛初乳中含量最為豐富，并具有多種生物活性功能，可以約束入侵的細(xì)菌、病毒等病原微生物的繁殖，并可以通過刺激引起特殊的反應(yīng)來幫助機(jī)體抵抗疾病，同時(shí)免疫球蛋白還具有活化補(bǔ)體、溶解細(xì)菌和中和毒素等功能[2]。本實(shí)驗(yàn)利用超濾膜法在物理?xiàng)l件下分離得到3 ku 以下牛初乳多肽，發(fā)現(xiàn)牛初乳中自然存在的小分子多肽同樣具有抑菌作用，為了進(jìn)一步確認(rèn)其抑菌作用成分的組成，將3 ku 以下的牛初乳多肽經(jīng)葡聚糖凝膠色譜 Sephadex G-50、Sephadex G-25、Sephadex G-15 和Sephadex G-10 進(jìn)行分離，將具有抑菌功效的成分再經(jīng)C18 反相色譜法分離，根據(jù)洗脫下來的峰型收集流分，得到F3組分。

多肽/蛋白質(zhì)N-端測(cè)序分析結(jié)果表明，我們得到的3 ku以下牛初乳多肽的氨基酸為NH2-Y-Q-EP-V-L-G-P-V，該序列經(jīng)網(wǎng)上相關(guān)報(bào)道比對(duì)分析為牛乳中的β-酪蛋白[12]。β-酪蛋白是母乳中蛋白質(zhì)的主要成分，屬于磷酸化蛋白的一種，它占乳蛋白含量的80%，是幼兒或幼崽生長發(fā)育主要蛋白來源，具有誘導(dǎo)體內(nèi)核酸合成，加速體內(nèi)細(xì)胞生長，促進(jìn)T 細(xì)胞成熟，提高免疫力等作用。酪蛋白有4 種主要的組成成分，它們分別是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，此外還有一些痕量的由β-酪蛋白水解產(chǎn)生的γ-酪蛋白[10，13-14]。酪蛋白是生物活性肽的重要來源，可以通過體內(nèi)的胃腸消化和食品加工過程中的酶解作用將其釋放出來。這些活性肽類包括磷酸肽，抗菌肽，降壓肽，和一些具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓形成以及阿片功能的肽類，從而具有重要而廣泛的生物學(xué)機(jī)能及調(diào)節(jié)功效[15]。

3 結(jié) 論

目前對(duì)于動(dòng)物初乳的研究往往限于其中的大分子生物活性物質(zhì)，對(duì)于天然的小分子物質(zhì)成分卻乏人問津；而與肽相關(guān)的報(bào)道也往往是針對(duì)經(jīng)過蛋白酶處理后的分解產(chǎn)物[16-17]。本研究在不利用酶解反應(yīng)的情況下，只通過超濾膜法進(jìn)行物理分離獲得了牛初乳中天然存在的蛋白多肽，并采用檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌生長曲線影響的策略驗(yàn)證了所獲得的小分子多肽具有一定的抑菌作用，較傳統(tǒng)的抑菌圈測(cè)定和平板菌落技術(shù)等方法簡(jiǎn)便且高效[17]；而將葡聚糖凝膠色譜及反相色譜法分離得到F3 組分經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序分析后證實(shí)為β-酪蛋白上的片段則提示了牛初乳中天然小分子多肽可能具有某些未知的功效，為初乳原料利用率的提高及產(chǎn)品制劑的研發(fā)提供了新的思路和依據(jù)。