屈雅莉，郭星，張影，肖淑珍，劉麗，劉文雅，張耀廣，柴艷兵，李飛，李興佳，劉志楠

(石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊050021)

0 引 言

抗生素應(yīng)用帶來經(jīng)濟(jì)增長的同時(shí)還帶來細(xì)菌耐藥性問題。當(dāng)前，該問題已成為全球性危機(jī)[1-4]，給公共衛(wèi)生安全造成了很大威脅[5-9]。

β-內(nèi)酰胺類抗生素具有殺菌性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)常被使用。如果飼養(yǎng)者濫用藥物可造成牛乳中的殘留，使用后會(huì)引起部分人過敏反應(yīng)或產(chǎn)生耐藥性，從而間接危害人體健康[10-12]。

目前國內(nèi)外對(duì)生牛乳的β-內(nèi)酰胺酶檢測主要有高效液相色譜法、碘量法和杯碟法[13-15]。高效液相色譜法操作復(fù)雜檢測成本高[16]。碘量法靈敏度差且不同樣本重復(fù)性差。杯碟法靈敏度高，易操作，易判定。

本研究采用杯碟法檢測生牛乳，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品酶活力和供試平板的厚度影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和設(shè)備

試劑：三級(jí)水，實(shí)驗(yàn)室自制；生理鹽水（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸鹽緩沖液，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

實(shí)驗(yàn)菌種：藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001第二代，CICC 10445第二代。

標(biāo)準(zhǔn)品：青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（Dr）、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（SIGMA、中國食品藥品檢定研究院）、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液（Dr）。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、抗生素檢定培養(yǎng)基II（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）。

儀器設(shè)備：生化培養(yǎng)箱36±1 ℃（BINDER），生物安全柜（ESCO）光度計(jì) 450 nm（賽默飛），pH 計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)，移液器(Thermo)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，恒溫水浴鍋（上海一恒），游標(biāo)卡尺，牛津杯，培養(yǎng)皿，離心管，陶瓦蓋。

1.2 方法

依據(jù)NY/T 3313-2018《生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測定》對(duì)生乳進(jìn)行測定，該方法檢出限為4 U/mL，原理為：杯碟法是使用對(duì)青霉素類藥物敏感的藤黃微球菌，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，同時(shí)加入青霉素作對(duì)照，比對(duì)加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品產(chǎn)生的抑菌圈的大小來間接測定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物[17]。

1.2.1 制備菌懸液優(yōu)化

采用不同來源的標(biāo)準(zhǔn)菌株：藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001 第二代和 CICC 10445 第二代分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h，分別記錄菌形態(tài)，于生物安全柜內(nèi)制備菌懸液。同時(shí)將以上菌懸液分別對(duì)50 組生鮮乳進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，該方法檢出限為4 U/mL，所以采用檢出限對(duì)不同菌株進(jìn)行驗(yàn)證，選出該方法的最適菌株。

1.2.2β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品制備優(yōu)化

從市面選取常見的3 個(gè)不同品牌的β- 內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品 (對(duì)青霉素敏感)，標(biāo)注分別為：≥8×106U/mL；≥6×106U/mL；≥3×106U/mL。選用3 個(gè)品牌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3 組加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每組50 個(gè)樣品，加標(biāo)量分別為2，4，8 U/mL，計(jì)算加標(biāo)結(jié)果，驗(yàn)證不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.2.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存條件優(yōu)化

青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備完成后，分別選用現(xiàn)配現(xiàn)用，常溫（20～25 ℃）貯存2，4，6，低溫（0～8 ℃）貯存2，4，6，24 h 的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為4 U/mL，每組50 個(gè)樣品本底，計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率，驗(yàn)證青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液不同貯存條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確定青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存的最優(yōu)條件。

1.2.4 檢測平板制備優(yōu)化

方法中要求添加藤黃微球菌的抗生素檢定培養(yǎng)基II 傾注量約為15～20 mL，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)傾注較厚的平板易產(chǎn)生“雙圈”現(xiàn)象，即在明顯抑制圈與非抑制圈之間有一圈不清晰（淺色帶）的抑菌圈，影響結(jié)果判定。本研究分為兩組，一組供試檢測平板傾注量約10～15 mL，另一組供試檢測平板傾注量約20～25 mL。兩組平板分別檢測50 個(gè)加標(biāo)樣品（加標(biāo)量4 U/mL），計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率，同時(shí)觀察平板抑菌圈形態(tài)，確定檢測平板制備的最優(yōu)化條件。

1.2.5 檢測平板貯存條件優(yōu)化

本文對(duì)供試檢測平板制備完成后的貯存條件進(jìn)行研究。選取在2～8 ℃貯存0，1，2，3，4 d 的供實(shí)檢測平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為4 U/mL，每組50 個(gè)樣品本底，計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率，確定檢測平板貯存最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備菌懸液優(yōu)化

采用不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株。藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001第二代菌36±1 ℃培養(yǎng)20～24 h菌落大，菌苔厚，利于制備菌懸液。CICC 10445 第二代菌株生長較慢，36±1 ℃培養(yǎng) 18～20 h 菌苔較小、透明且薄，不利于菌懸液制備，若使用CICC 10445 作為實(shí)驗(yàn)菌株最好選用活化培養(yǎng)22～24 h 的菌苔制備菌懸液（見表1）。

表1 不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)情況

圖1 兩種來源標(biāo)準(zhǔn)菌株36±1 ℃培養(yǎng)20 h菌落形態(tài)

采用兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為4 U/mL。使用CMCC（B）28001 第二代菌的實(shí)驗(yàn)組陽性檢出率為100%，使用CICC 10445 第二代菌的實(shí)驗(yàn)組陽性檢出率為100%。兩種菌株的檢出率一致，對(duì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異（見表2）。

表2 采用不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株加標(biāo)實(shí)驗(yàn)陽性檢出情況

2.2 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品制備優(yōu)化

采用3 個(gè)品牌對(duì)青霉素敏感的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品2 U/mL 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（圖2），其中品牌1 的β-內(nèi)酰胺酶活力較高，72%的樣品檢出陽性，但后期排查的成本較高；4 U/mL（檢出限）加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（圖3），陽性檢出率分別為100%，100%，84%；品牌1 和品牌2 漏檢率0%，品牌3 漏檢率為16%，采用品牌3 的β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)有很大漏檢風(fēng)險(xiǎn)；8 U/mL 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（圖4），3 個(gè)品牌陽性檢出率均為100%。

本研究的檢出限為4 U/mL，采用品牌1 可滿足方法要求，但有72%概率出現(xiàn)假陽性，會(huì)造成資源浪費(fèi)；品牌2 可滿足方法要求；品牌3 不能滿足方法要求，有16%的漏檢概率。采用不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。

圖2 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品2 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

圖3 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品4 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

圖4 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品8 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

2.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存條件優(yōu)化

采用低溫（0～8 ℃）貯存不同時(shí)間的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可以看出，隨著貯存時(shí)間延長，青霉素分解，加標(biāo)樣品陽性檢出率逐步降低。低溫貯存時(shí)間0～2 h 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液陽性檢出率為100%，漏檢率0%；低溫貯存時(shí)間＞2 h，存在不同程度漏檢的概率。本研究青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成后低溫貯存時(shí)間最優(yōu)為0～2 h。

采用常溫（20～25 ℃）貯存不同時(shí)間的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可以看出，隨著貯存時(shí)間延長，加標(biāo)樣品陽性檢出率逐步降低。常溫貯存時(shí)間0～6 h，存在不同程度漏檢的概率。青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不可常溫貯存。

圖5 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液低溫貯存不同時(shí)間檢出情況

圖6 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液常溫貯存不同時(shí)間檢出情況

2.4 檢測平板制備優(yōu)化

采用傾注量為10～15 mL 的供試檢測平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的陽性檢出率為100%，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測平板抑菌圈邊界清晰可見，易于判斷結(jié)果（圖7）。

圖7 β-內(nèi)酰胺酶檢測平板抑菌圈形態(tài)

采用傾注量為20～25 mL 的供試檢測平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，存在不同程度的漏檢概率，主要是由于檢測平板抑菌圈邊界不清晰，且一部分出現(xiàn)“雙圈”現(xiàn)象，且以外圈計(jì)和內(nèi)圈計(jì)結(jié)果不一致，不易判斷檢測結(jié)果。本研究結(jié)果表明，供實(shí)檢測平板的傾注量10～15 mL最優(yōu)（見表3）。

表3 采用不同傾注量檢測平板加標(biāo)實(shí)驗(yàn)陽性檢出情況

2.5 檢測平板貯存條件優(yōu)化

采用低溫（2～8 ℃）貯存不同時(shí)間的供試檢測平板進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，隨著平板保存時(shí)間延長，陽性樣品檢出率降低。使用低溫（2～8 ℃）貯存0～1 d 供試檢測平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（加標(biāo)量4 U/mL），陽性檢出率為100%，使用低溫（2～8 ℃）貯存2～4 d供試檢測平板加標(biāo)實(shí)驗(yàn)存在不同程度漏檢的概率。本研究供實(shí)檢測平板冷藏貯存的時(shí)間最優(yōu)為0～1 d，建議現(xiàn)配現(xiàn)用（圖8）。

圖8 采用不同貯存時(shí)間檢測平板的檢出情況

3 結(jié)果與討論

用杯碟法檢測β-內(nèi)酰胺酶，主要是利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對(duì)照，通過比對(duì)抑菌圈的大小來間接測定樣品中有無含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物[18]。試驗(yàn)中菌株、β-內(nèi)酰胺酶、青霉素等是試驗(yàn)中應(yīng)注意的關(guān)鍵因素，把控其最優(yōu)條件有利于提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[19-20]。

通過分析試驗(yàn)結(jié)果，采用藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001 和 CICC 10445 作為實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性無明顯影響，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身情況選擇性購買標(biāo)準(zhǔn)菌株，但考慮到兩種菌株的生長特性，藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001 建議使用活化20～24 h 的培養(yǎng)物制備菌懸液，CICC 10445建議使用活化22～24 h的培養(yǎng)物制備菌懸液。

采用不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響，建議實(shí)驗(yàn)開展之前對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的酶活力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可采用檢出限附近加標(biāo)回收的方式驗(yàn)證其活力是否符合實(shí)驗(yàn)要求。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液隨著貯存時(shí)間延長會(huì)逐步衰減，貯存溫度越高衰減越快。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液不可常溫貯存，建議青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成后最好立即實(shí)驗(yàn)，若無法立即實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于冰水混合物中2 h完成實(shí)驗(yàn)。

供試檢測平板的厚度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定有影響，偏厚的平板易產(chǎn)生“雙圈”現(xiàn)象，本次試驗(yàn)顯示檢測平板的最優(yōu)傾注量為10～15 mL，傾注的時(shí)候可以先傾注一部分含菌培養(yǎng)基至無菌平皿上，輕微旋轉(zhuǎn)平板，使培養(yǎng)基流動(dòng)平鋪于整個(gè)無菌平皿上，可得到較薄測試平板。

供實(shí)檢測平板最優(yōu)現(xiàn)配現(xiàn)用，若配置較多平板或?qū)嶒?yàn)需求，在冰箱冷藏貯存1 d 可達(dá)同等效果。實(shí)驗(yàn)中注意：可待檢測平板凝固后即刻放入2～8 ℃冰箱冷藏保存，若室溫放置時(shí)間較長造成藤黃微球菌大量生長，則平板不可使用。