付 妍，張亞雙，王亞瓊，張華鋒，陳 衛(wèi)，周 堅(jiān)，邢以文，薛 滿

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215014)

枸橘為蕓香科(Rutaceae)植物枸橘PoncirustrifoliataL. Rafin.的近成熟果實(shí)，被《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2016年版)》收載。有關(guān)研究表明[1-3]，枸橘中含有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類、生物堿類、有機(jī)酸類、萜類等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[4-13]，枸橘具有抗腫瘤、抗過敏、抗病毒、調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)等作用。經(jīng)對(duì)本草考證，枸橘又名綠衣枳實(shí)。有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定枸橘中柚皮苷的含量[14]，但若只測(cè)定其中一個(gè)組分的含量顯然不能全面有效地控制枸橘的質(zhì)量。目前，特征指紋圖譜是控制中藥質(zhì)量的有效方法之一。通過文獻(xiàn)檢索和研究發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)的梯度洗脫程序能較好地分離枸橘中各組分，較全面地反映枸橘組成的整體信息，故選擇HPLC作為枸橘特征指紋圖譜的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司，包括Waters-2489四元泵、Waters-2998二極管陣列檢測(cè)器、Empor化學(xué)工作站]；KQ-250B型超聲清洗機(jī)(昆山超聲電子設(shè)備廠)。

甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；冰醋酸為分析純；對(duì)照品柚皮苷(批號(hào)：110722-201111，純度：93.2%)和歐前胡素(批號(hào)：110722-201111，純度：99.6%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；15批枸橘藥材由蘇州市天靈中藥飲片有限公司等6家企業(yè)提供，經(jīng)蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心中藥室張華鋒主任鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取柚皮苷對(duì)照品、歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml各含柚皮苷150 μg、歐前胡素60 μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取枸橘藥材粉末(過四號(hào)篩，批號(hào)：151219)，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 50 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

Diamonsil Plus C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇(A)-1%冰醋酸溶液(B)為流動(dòng)相，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm，柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫表

2.4 色譜峰的確認(rèn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入HPLC儀。供試品HPLC見圖1，圖中呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，與參照物柚皮苷峰相對(duì)應(yīng)的峰為峰2，計(jì)算各特征峰與峰2的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，其規(guī)定值為：0.97(峰1)、1.00(峰2)、1.22(峰3)、1.24(峰4)、1.62(峰5)、2.04(峰6)。

峰2(S)：柚皮苷;峰5：歐前胡素圖1 枸橘藥材的HPLC圖

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1精密度試驗(yàn)

取同一樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液，進(jìn)樣10 μl分析，一共進(jìn)樣6次，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果：各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，說明該儀器的精密度良好。

2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：15041403)共6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液，進(jìn)樣10 μl，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果：各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：15041403)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液，分別于0、2、4、8和12 h進(jìn)樣一次，共測(cè)定12 h，分別進(jìn)樣10 μl，考察特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果：各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，說明樣品供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4不同柱溫考察

采用Diamonsil Plus C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，分別考察了28、30和35 ℃。結(jié)果：不同柱溫對(duì)其分離度基本上沒有影響，考慮到色譜柱的耐受性以及分析時(shí)間的長(zhǎng)短，故確定色譜柱的溫度為30 ℃。

2.5.5不同色譜柱考察

取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：15041403)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液，采用Waters Symmetry Shield RP18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil Plus C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Boston Green ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：Diamonsil Plus C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)檢出的色譜峰較多，且分離度良好，故選擇此色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.6 特征指紋圖譜的建立

取15批枸橘藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版，15批枸橘藥材HPLC指紋圖譜見圖2，相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見表2。

圖2 15批枸橘藥材的HPLC特征指紋圖譜

表2 15批樣品的相對(duì)保留時(shí)間min

3 討論

目前市場(chǎng)上枸橘藥材的質(zhì)量良莠不齊，建立一個(gè)可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。本研究建立的方法可以和枸橘藥材的含量測(cè)定一起作為控制枸橘藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，可以有效地監(jiān)控枸橘藥材的組成與質(zhì)量恒定性，為市場(chǎng)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，以峰數(shù)和分離度為指標(biāo)，將樣品在200～400 nm進(jìn)行掃描，分別考察了220、240、283、300和360 nm波長(zhǎng)下的色譜峰，結(jié)果283 nm下的色譜峰分離較好，考慮到柚皮苷作為參考峰，且柚皮苷的最大吸收波長(zhǎng)也在283 nm，因此最終確定283 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)中采用不同的提取溶劑，樣品的色譜峰基本一致，結(jié)合《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2016年版枸橘項(xiàng)下，確定甲醇作為提取溶劑。樣品超聲處理不同時(shí)間，其HPLC圖基本一致，為提取完全，確定提取時(shí)間為30 min。