鄭國(guó)燦 ,徐亞龍 ,董浩然 ,趙 爽 ,宮敬禹

(1.重慶大學(xué)分析測(cè)試中心,重慶 401331; 2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 401331;3.重慶大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,重慶 400044; 4.重慶登康口腔護(hù)理用品股份有限公司,重慶 400025)

苯扎氯銨是一種季銨鹽類(lèi)陽(yáng)離子殺菌劑,是由正烷烴基取代的二甲基芐基氯化銨的同系物組成,主要以十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12-BAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14-BAC)和十六烷基二甲基芐基氯化銨(C16-BAC)為主。3種同系物具有不同的殺菌特性,C12-BAC 對(duì)酵母菌和真菌具有抑制作用,C14-BAC和C16-BAC 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌具有抑制作用[1],3種同系物往往配合使用,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用產(chǎn)品、化妝品、日化用品中。苯扎氯銨對(duì)眼睛、皮膚具有強(qiáng)烈的刺激性,過(guò)量使用會(huì)引起人身傷害,GB 22115－2008《牙膏用原料規(guī)范》和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定化妝品及牙膏中苯扎氯銨的限量均為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

目前苯扎氯銨的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法[2]、毛細(xì)管電泳法[3-4]、高效液相色譜法[5-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。紫外分光光度法易受樣品基質(zhì)的干擾,且只能測(cè)定苯扎氯銨總量;毛細(xì)管電泳法試劑消耗量少,但方法的穩(wěn)定性易受樣品介質(zhì)和基質(zhì)的影響;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器設(shè)備昂貴,但靈敏度較高,適用于禁用苯扎氯銨產(chǎn)品的分析;高效液相色譜法因其儀器設(shè)備具有普適性被廣泛采用,其靈敏度適合化妝品[5,8]、包裝材料[7]、日化用品[9]、醫(yī)用產(chǎn)品[10-11]等限用苯扎氯銨產(chǎn)品的測(cè)定。在高效液相色譜法中,常用C18柱[7,9,11]、氰基(CN)柱[6,8,10]、強(qiáng)陽(yáng)離子(SCX)柱[5]作為分離色譜柱,其中CN 柱和SCX 柱,因其對(duì)苯扎氯銨具有較好特異性而被經(jīng)常采用,而C18柱對(duì)苯扎氯銨的特異性較差,往往需添加離子對(duì)試劑作為流動(dòng)相,以改善峰形和選擇性。鑒于目前牙膏中苯扎氯銨含量的測(cè)定方法報(bào)道較少,本工作采用高效液相色譜法,以CN 柱分離,利用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定牙膏中C12-BAC、C14-BAC和C16-BAC 等3 種苯扎氯銨同系物的含量,本方法前處理簡(jiǎn)單,靈敏度和選擇性較好,可為牙膏質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A 型液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器(DAD);H1850R 型冷凍離心機(jī);VORTEX 2型渦旋振蕩器;DY-10-240DTL型超聲波清洗機(jī)。

3種苯扎氯銨同系物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10.0 g·L－1,分別稱(chēng)取3 種苯扎氯銨同系物的對(duì)照品各1.000 0 g,以適量甲醇溶解后,用甲醇定容至100.0 mL,于4 ℃保存。使用時(shí)用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

C12-BAC、C14-BAC 和C16-BAC 對(duì)照品的純度不小于99.5%;所用試劑均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

GL Sciences CN-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;進(jìn)樣量10μL;流量1.0 mL·min－1。流動(dòng)相為乙腈與0.1 mol·L－1乙酸銨溶液以體積比1∶1組成的混合液;等度洗脫。

1.3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取市售牙膏樣品1.000 0 g于50 mL 尖嘴離心管中,加數(shù)顆玻璃珠,加甲醇10 mL,渦旋振蕩2 min,使牙膏完全分散,再超聲提取10 min,在8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心5 min,上清液經(jīng)0.45μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后,取濾液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對(duì)3種苯扎氯銨同系物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種苯扎氯銨同系物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 3 homologues of benzalkonium chloride

按試驗(yàn)方法對(duì)空白樣品和加標(biāo)樣品進(jìn)行分析,色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖1和圖2可見(jiàn):在色譜條件下,3種苯扎氯銨同系物均達(dá)到完全分離,峰形良好。

2.2 提取溶劑及提取方式的選擇

苯扎氯銨易溶于水、醇等極性溶劑,而牙膏基質(zhì)比較復(fù)雜,選擇提取溶劑時(shí)需要充分考慮牙膏的溶解性和分散性。

圖2 樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the samples

試驗(yàn)中采用水、甲醇、乙醇、乙腈等4種提取溶劑對(duì)牙膏陽(yáng)性樣品進(jìn)行提取。試驗(yàn)結(jié)果表明:水能夠完全分散牙膏樣品,牙膏樣品溶液黏稠;甲醇能部分溶解牙膏樣品,基質(zhì)中碳酸鈣等無(wú)機(jī)鹽不溶解,牙膏樣品溶液的分散性較好;乙醇也能部分溶解牙膏樣品,牙膏樣品溶液的分散性較甲醇作為提取溶劑時(shí)牙膏樣品溶液的分散性差;乙腈作為提取溶劑時(shí),牙膏樣品溶液的分散性最差,牙膏樣品成坨狀。苯扎氯銨的提取效率由大到小依次為甲醇、水、乙醇、乙腈。試驗(yàn)選擇提取溶劑為甲醇。

采用渦旋振蕩和超聲提取相結(jié)合的方式對(duì)苯扎氯銨進(jìn)行提取,提取時(shí)加入玻璃珠,使牙膏樣品進(jìn)行充分分散與溶解。

試驗(yàn)中考察了牙膏樣品的渦旋時(shí)間和超聲時(shí)間對(duì)苯扎氯銨提取效率的影響。結(jié)果表明:牙膏樣品渦旋振蕩2 min、超聲提取10 min就能進(jìn)行充分的分散與溶解,苯扎氯銨的提取效率最高。試驗(yàn)中牙膏樣品渦旋振蕩2 min、超聲提取10 min。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

苯扎氯銨的分離可以采用C18柱、CN 柱、SCX柱等不同類(lèi)型的色譜柱。使用C18柱時(shí),流動(dòng)相需要添加庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑[7,11],或者加入三乙胺作為掃尾劑[9],以改善峰形和選擇性。為了簡(jiǎn)化流動(dòng)相體系,試驗(yàn)以乙腈-乙酸銨體系作為流動(dòng)相(等度洗脫),考察了CN 柱、SCX 柱對(duì)3種苯扎氯銨同系物的分離情況。

結(jié)果表明:采用CN 柱、SCX 柱時(shí),3種苯扎氯銨同系物的分離情況以及峰形等比較類(lèi)似。試驗(yàn)選擇色譜柱為CN 柱。

2.3.2 流動(dòng)相

根據(jù)文獻(xiàn)[10],試驗(yàn)采用乙腈-乙酸銨體系作為流動(dòng)相(等度洗脫)。試驗(yàn)首先用乙酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸度,考察了流動(dòng)相的酸度對(duì)樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 流動(dòng)相的酸度對(duì)樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響Fig.3 Effect of acidity of mobile phase on separation of impurities and 3 homologues of benzalkonium chloride in sample

由圖3 可知:隨著pH 的增加,樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物的分離度越來(lái)越大;當(dāng)pH 增加至6～7時(shí),樣品中所有雜質(zhì)的保留時(shí)間均小于3種苯扎氯銨同系物的保留時(shí)間,3種苯扎氯銨同系物的測(cè)定完全不受雜質(zhì)干擾。這可以確定在接近中性的條件下雜質(zhì)的保留行為和3種苯扎氯銨同系物的保留行為有較大的區(qū)別。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化流動(dòng)相的配制,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相的pH 約為7,即流動(dòng)相中不加乙酸。

試驗(yàn)其次考察了流動(dòng)相中乙腈的比例對(duì)樣品中雜質(zhì)和3 種苯扎氯銨同系物分離的影響。結(jié)果表明:乙腈的比例從45%增至65%(以5%幅度遞增)時(shí),樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物均能完全分離,即樣品中雜質(zhì)不干擾3種苯扎氯銨同系物的分離;乙腈的比例大于65%時(shí),3種苯扎氯銨同系物不能完全分離。由試驗(yàn)結(jié)果還可知:乙腈的比例對(duì)3種苯扎氯銨同系物的保留時(shí)間和峰形有較大的影響,乙腈比例越高,3種苯扎氯銨同系物的保留時(shí)間越短,分離度也變小,特別是雜質(zhì)峰與C12-BAC 的分離度。流動(dòng)相中乙腈的比例為50%,55%,60%時(shí),3種苯扎氯銨同系物的保留時(shí)間和分離度均比較理想。試驗(yàn)選擇流動(dòng)相中乙腈的比例為50%。

試驗(yàn)最后考察了乙酸銨的濃度對(duì)樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響。結(jié)果表明:隨著乙酸銨濃度的增大,3種苯扎氯銨同系物的分離度逐漸減小,但是峰形越來(lái)越好,保留時(shí)間越來(lái)越小,其與樣品中干擾峰的分離度也越來(lái)越小;乙酸銨的濃度為0.1 mol·L－1時(shí),3種苯扎氯銨同系物的峰形較對(duì)稱(chēng)。試驗(yàn)選擇乙酸銨的濃度為0.1 mol·L－1。

2.3.3 柱溫

柱溫較高能減少分析時(shí)間,但柱溫越高,目標(biāo)物的分離度越小。試驗(yàn)考察了柱溫依次為20,25,30,35,40 ℃時(shí),3種苯扎氯銨同系物的分離情況。結(jié)果表明:柱溫為20,25,30 ℃時(shí),3種苯扎氯銨同系物的峰形基本差異不大,隨著柱溫的升高,3種苯扎氯銨同系物的分離度小幅減小,但都達(dá)到基線分離,整體保留時(shí)間逐漸變小;柱溫為35 ℃時(shí),C16-BAC的峰形開(kāi)始稍稍變差;柱溫為40 ℃時(shí),C16-BAC 的峰形變?yōu)槠脚_(tái)峰。因此,柱溫不應(yīng)超過(guò)35℃。由試驗(yàn)結(jié)果還可以看出:柱溫較低時(shí)不會(huì)影響3種苯扎氯銨同系物的分離度和峰形;柱溫越低,3種苯扎氯銨同系物的保留時(shí)間越長(zhǎng)。試驗(yàn)選擇柱溫為30℃?？紤]到實(shí)際的試驗(yàn)條件,若儀器沒(méi)有配備柱溫箱或者柱溫箱沒(méi)有制冷的功能,應(yīng)控制環(huán)境溫度不超過(guò)35 ℃。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按色譜條件對(duì)5,10,20,50,100,200,500 mg·L－1的3種苯扎氯銨同系物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:3種苯扎氯銨同系物的質(zhì)量濃度均在5～500 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N),根據(jù)10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白牙膏樣品(樣品基質(zhì)依次為碳酸鈣、磷酸二氫鈣、二氧化硅)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)量為100,1 000,2 000 mg·kg－1,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知:回收率為97.4%～107%,RSD 為0.21%～5.2%。

2.6 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)不同基質(zhì)的20種市售牙膏樣品進(jìn)行分析,其中6種牙膏樣品檢出3種苯扎氯銨同系物,其余14種牙膏樣品均未檢出3種苯扎氯銨同系物,所檢陽(yáng)性樣品中3種苯扎氯銨同系物的含量均未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1 000 mg·kg－1的限量,均為合格。

本工作建立了測(cè)定牙膏中3種苯扎氯銨同系物含量的HPLC-DAD 方法。本方法前處理簡(jiǎn)單、分析快速,可用于實(shí)際樣品分析,易在基層檢測(cè)單位推廣使用。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)