陳紹占,劉麗萍,3?,張妮娜,周天慧

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室,北京 100013;2.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100013; 3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京100069)

汞在自然界中分布很廣,汞是對人類和環(huán)境最具危害性的元素之一。食品中的汞污染由來已久,汞的測定一直是食品安全關(guān)注的問題。汞及其化合物具有很強的毒性,汞對生物的毒性不僅取決于其含量,更與其存在的化學(xué)形態(tài)及生物本身密切相關(guān),一般來說,烷基汞的毒性比芳基汞和無機汞的毒性大[1]。無機汞易通過生物甲基化作用生成毒性更強的烷基汞,并通過食物鏈的富集作用進入人體,對環(huán)境和人類健康構(gòu)成極大的安全隱患[2]。相比于綠色植物,蘑菇更易富集高含量的鉛、砷、鎘和汞等重金屬元素,這會給消費者帶來嚴(yán)重危害[3-5]。雖然GB/T 2762－2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定了食用菌及其制品中總汞限量為0.1 mg·kg－1,但僅對水產(chǎn)動物及其制品、肉食性魚類及其制品中甲基汞的含量進行了規(guī)定。我國是食用菌消費大國,也是食用菌出口大國,因此準(zhǔn)確測定食用菌中甲基汞的含量對食品安全風(fēng)險評估具有重要意義。目前關(guān)于食用菌中甲基汞測定的報道較少,急需建立相應(yīng)的測定方法以保障食品安全。

目前,常見的測定汞形態(tài)的方法主要有液相色譜-原子熒光光譜法(LC-AFS)[6-8]、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(LC-ICP-MS)[9-11]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12-14]。其中LC-ICP-MS 具有連接簡單、靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強等優(yōu)點,已成為測定汞形態(tài)的主流方法之一。因此,本工作采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)對食用菌中的無機汞及甲基汞進行測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀;7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;Milliplus 2150型超純水處理系統(tǒng);KQ-500DV 型數(shù)控超聲清洗器(可控溫20～80 ℃);Universal 32 型高速離心機;8010s 型粉碎機。

無機汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100μg·g－1。

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:(65.2±2.5)μg·g－1,以甲醇為溶劑。

調(diào)諧液:含1μg·L－1的鋰、鎂、釔、鈰、鉈、鈷。

鹽酸、氨水均為優(yōu)級純;乙酸銨為分析純;L-半胱氨酸為生化試劑;甲醇為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)HPLC 條件 Agela Technologies Venusil MP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流動相為3%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇-40 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液;流量1.0 mL·min－1;進樣體積50μL。

2)ICP-MS條件 射頻功率1 550 W;采樣深度8 mm;霧化室溫度2 ℃;載氣流量0.85 L·min－1,補償氣流量0.15 L·min－1;監(jiān)測質(zhì)量數(shù)為202;積分時間為0.5 s;蠕動泵轉(zhuǎn)速為0.3 r·s－1。

1.3 試驗方法

稱取干食用菌樣品0.200～1.000 g置于15 mL塑料離心管中,加入5 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,在冰水浴中超聲提取60 min,期間振搖數(shù)次,然后在4℃下以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心15 min。移取2 mL上清液至5 mL容量瓶或刻度試管中,在冰水浴中逐滴加入50%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水,調(diào)節(jié)樣品溶液pH 至3～7,再加入10 g·L－1L-半胱氨酸溶液0.1 mL,最后用水稀釋至刻度,經(jīng)0.45μm 有機系濾膜過濾,在儀器工作條件下進行測定。同時做空白試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗初期以甲醇-60 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液作為流動相,考察了流動相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)依次為1%,2%,3%,4%,5%時對無機汞和甲基汞的峰面積和保留時間的影響,結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對無機汞和甲基汞峰面積的影響Fig.1 Effect of volume fraction of methanol on peak area of inorganic mercury and methylmercury

圖2 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對無機汞和甲基汞保留時間的影響Fig.2 Effect of volume fraction of methanol on retention time of inorganic mercury and methylmercury

由圖1可知:流動相中加入甲醇對無機汞、甲基汞的測定具有增敏作用;當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)超過3%時,增敏作用不再明顯增強;甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%時,無機汞的信號最佳;隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,甲基汞的峰面積逐漸增加。

由圖2可知:隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,無機汞的保留時間基本不發(fā)生變化,甲基汞的保留時間逐漸減小。故甲醇體積分?jǐn)?shù)過大,會導(dǎo)致無機汞和甲基汞分離度變差。

綜上所述,同時考慮到長時間將高含量的有機相進入儀器,會在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的采樣錐和截取錐上產(chǎn)生碳富集,進而影響靈敏度,對采樣錐和截取錐損耗也較大。試驗選擇流動相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)3%。

在實際樣品分析過程中發(fā)現(xiàn):食用菌樣品中無機汞含量過高會導(dǎo)致峰拖尾,從而影響甲基汞的測定。為了保證無機汞和甲基汞具有較好的分離度,試驗中適當(dāng)降低流動相中乙酸銨的濃度,同時該操作還可以有效延長色譜柱的使用壽命。綜合考慮,試驗選擇流動相為3%甲醇-40 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液。

2.2 ICP-MS條件的選擇

開機預(yù)熱后,使用調(diào)諧液對儀器各項參數(shù)進行調(diào)諧,使靈敏度、氧化物、雙電荷及背景噪聲達到要求,將優(yōu)化的各項參數(shù)保存到分析方法中。

汞在自然界中共有6個同位素,其中豐度比較高的同位素有199Hg、200Hg、201Hg、202Hg,豐度分別為16.87%,23.10%,13.18%,29.86%。上述同位素分別容易受到183W16O、184W16O、185Re16O、186W16O等多原子離子的干擾,然而可能存在干擾的物質(zhì)幾乎不存在于食品基體中。試驗選擇了豐度最高的202Hg的質(zhì)量數(shù)202 作為監(jiān)測的質(zhì)量數(shù),樣品基質(zhì)中無質(zhì)譜干擾。

試驗選擇的ICP-MS條件見1.2節(jié)。

2.3 前處理條件的選擇

目前食品樣品的提取多采用5 mol·L－1鹽酸溶液作為提取劑。高效液相色譜-原子熒光光譜法測定汞形態(tài)可采用氫氧化鈉溶液中和鹽酸溶液調(diào)節(jié)酸度。但采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定時,采用氫氧化鈉溶液中和鹽酸溶液會引入高含量的鈉鹽,導(dǎo)致等離子體的電離效率及穩(wěn)定性降低,影響數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性。試驗選用50%氨水調(diào)節(jié)酸度。

樣品溶液酸堿性對無機汞和甲基汞測定的影響見圖3。

圖3 樣品溶液酸堿性對無機汞和甲基汞測定的影響Fig.3 Effect of acidity and alkalinity of sample solution on determination of inorganic mercury and methylmercury

由圖3可知:若樣品溶液調(diào)至弱堿性,無機汞和甲基汞保留時間后移,且在無機汞原出峰位置有個明顯的倒峰,影響無機汞的測定,導(dǎo)致無機汞測定結(jié)果偏低。試驗選擇樣品溶液為弱酸性。Agela Technologies Venusil MP C18色譜柱屬于中等極性柱,適用pH 范圍較寬(1.5～8.5)。將pH 控制在3～7即可保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,又可有效保護色譜柱。

超聲提取時,為避免水分子振蕩摩擦使水溫升高,可通過加注冰水降溫使水溫控制在50 ℃以下。

中和反應(yīng)滴加50%氨水速率不宜太快,避免酸堿中和放熱劇烈導(dǎo)致無機汞揮發(fā)或甲基汞形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化,影響測定結(jié)果。滴加50%氨水時應(yīng)在冰水浴下逐滴緩慢加入。

2.4 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的溶劑為甲醇,其在冰箱冷凍室(－20 ℃)可保存兩年。試驗中首先用50%甲醇溶液將甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成10.00 mg·L－1甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液,再用流動相將10.00 mg·L－1甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋至50.00μg·L－1,按儀器工作條件進行測定,監(jiān)測24 h 內(nèi)的變化。結(jié)果顯示:24h 內(nèi)有0.11%的甲基汞轉(zhuǎn)化為無機汞,為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的無機汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用流動相稀釋混合配制成0,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00,30.00,50.00μg·L－1的無機汞和甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列(現(xiàn)用現(xiàn)配)。按儀器工作條件對無機汞和甲基汞的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定,以無機汞和甲基汞的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:無機汞和甲基汞的線性范圍均為0.10～50.00μg·L－1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的檢出限(3S/N),無機汞和甲基汞的檢出限見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.6 精密度和回收試驗

按試驗方法對食用菌樣品進行分析,并進行加標(biāo)回收試驗,平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:無機汞的回收率為99.4%～103%,RSD 為1.6%～3.0%;甲基汞的回收率為94.6%～96.6%,RSD 為1.7%～4.7%。

2.7 樣品溶液的穩(wěn)定性

向真姬菇樣品中加入適量的無機汞和甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗方法進行分析,監(jiān)測24 h內(nèi)測定結(jié)果的變化情況,結(jié)果見表3。

由表3可知:在監(jiān)測時間內(nèi)無機汞的平均回收率為106%,甲基汞的平均回收率為95.5%,說明本方法的穩(wěn)定性良好。隨著監(jiān)測時間的延長,無機汞的測定值有逐漸增大的趨勢,甲基汞的測定值有逐漸降低的趨勢,說明甲基汞在樣品溶液中存在微量轉(zhuǎn)化的情況。因此,樣品提取完成后應(yīng)在12 h(甲基汞回收率為95.0%)內(nèi)完成測定,避免長時間放置導(dǎo)致甲基汞向無機汞的轉(zhuǎn)化。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.3 Results of test for stability

2.8 方法對比試驗

分別按試驗方法和GB/T 5009.17－2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機汞的測定》中的LC-AFS測定3種食用菌樣品中無機汞和甲基汞的含量,結(jié)果見表4。

表4 方法對比試驗結(jié)果Tab.4 Results of test for method comparison μg·kg－1

經(jīng)配對T檢驗,3種食用菌樣品的P值均大于0.05,說明兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義,兩種方法測定無機汞和甲基汞的結(jié)果一致。

2.9 樣品分析

按試驗方法對7種食用菌樣品中的汞形態(tài)進行測定,結(jié)果見表5,其中,無機汞、甲基汞總量為無機汞、甲基汞含量的總和,總汞為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定結(jié)果。

由表5可知:樣品中無機汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為457～1 526 μg·kg－1,甲基汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.6～134μg·kg－1;無機汞與總汞比值為73.0%～94.4%,甲基汞與總汞比值為1.2%～7.6%;提取效率為80.6%～96.2%。食用菌中汞的形態(tài)主要為無機汞,甲基汞的占比較小。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of samples

本工作采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定食用菌中無機汞和甲基汞的含量。方法操作簡單、靈敏度高、精密度高、準(zhǔn)確度好,與液相色譜-原子熒光光譜法進行對比,結(jié)果一致,本方法適用于食用菌中無機汞和甲基汞的測定。