陳海燕　張文鴻　朱正虎　石飛

摘 要：本文通過改變高效液相色譜的流動相研究對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的出峰峰形的影響。從而說明流動相對檢測結(jié)果的重要性。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;流動相;峰形

3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸是二硝托胺（球痢靈）中間體，二硝托胺（球痢靈）化學(xué)名為3，5-二硝基鄰甲基苯甲酰胺。二硝托胺（球痢靈）結(jié)構(gòu)式見圖1。

二硝托胺常作為抗球蟲藥，用于雞球蟲病。在飼料行業(yè)中成為搶手貨，頗受國內(nèi)外用戶的青睞。需求量比較大。對產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高。中間體的質(zhì)量決定了產(chǎn)品的質(zhì)量和效益。因此對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸進(jìn)行分析。其結(jié)構(gòu)式見圖2。

原來二硝托胺中間體的檢測方法是測其熔點，該物質(zhì)為淺黃色粉末，熔點：198℃-205.0℃。熔點儀測試該物質(zhì)有一定的局限性。因現(xiàn)在的儀器越來越先進(jìn)，越來越精密，對于該物質(zhì)完全可以用科學(xué)有效的分析方法來測定。高效液相色譜法（HPLC）來鑒別和分析該物質(zhì)是有效可靠的方法。HPLC的優(yōu)點：速度快，分辨率高，靈敏度高，柱子可反復(fù)使用，使用樣品量少。不同的物質(zhì)需要不同性質(zhì)的柱子和相應(yīng)流動相的配比。高效液相色譜法是目前及其常見的分析方法。在高效液相色譜法中，測定法有4種：內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、主成分自身對照法、面積歸一化法。有關(guān)物質(zhì)檢測常用外標(biāo)法、主成分自身對照法、面積歸一化法，其中主成分自身對照法又分為加校正因子主成分自身對照法，不加校正因子主成分自身對照法。本文主要討論面積歸一化法。

1 高效液相色譜

高效液相色譜目前在檢測工作中廣泛使用，對檢驗進(jìn)行質(zhì)量控制是保證結(jié)果可靠、準(zhǔn)確的基本要求。在高效液相檢測過程中，通過綜合使用系統(tǒng)適用性、空白分析、質(zhì)控樣品、重復(fù)分析、室內(nèi)質(zhì)量控制、不確定度評定等質(zhì)控手段，根據(jù)實驗室實際條件和風(fēng)險評估原則選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控手段，從而保證高效液相檢測過程中的質(zhì)量，保證便捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的高效液相檢測結(jié)果。高效液相色譜法一要了解其分離的基本原理，二要了解其的基本構(gòu)造，三要了解其的基本操作。

在高效液相測試中流動相要求和配比在高效液相色譜操作過程中起關(guān)鍵作用。流動相的性質(zhì)要求：一個理想的液相色譜流動相應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

流動相選擇：①由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進(jìn)行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）的比例;②三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況;③粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

流動相的脫氣：HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。

流動相的濾過：所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標(biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”）。

流動相的貯存：流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。一般情況下，甲醇--水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小，價格低，是反相色譜最常用的流動相。乙腈--水系統(tǒng)，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，看起來乙腈--水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇--水系統(tǒng)。但參考資料：乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍，價格是甲醇的6-7倍。擇優(yōu)選擇溶劑是流動相的關(guān)鍵。流動相首選甲醇--水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相。如為堿性流動相的pH值應(yīng)為7～8，如為酸性流動相的pH值應(yīng)為3～4。綜上所述，對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的測定首選甲醇--水系統(tǒng)。

2 實驗驗證

2.1 儀器設(shè)備及試劑

檢測儀器：Waters2489檢測器，515泵。

色譜柱：Kromasil C184.6×150mm或同等柱子。

天平：Mettler AB135S或同等設(shè)備。

玻璃儀器：A級計量儀器或同等儀器。

水：二次蒸餾水。

甲醇：HPLC級。

樣品：3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸。

2.2 實驗操作

條件1：流動相：甲醇：水=500：500;波長230nm。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg

于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL該溶液于100mL容量瓶中，用流動相（甲醇：水=500：500）稀釋至刻度。

色譜條件：波長：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間10min。

具體分析如圖3：

條件2：流動相：甲醇：水：稀磷酸=300：700：60;波長230nm。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg，于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動相（甲醇：水：稀磷酸=300：700：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間30min。

具體分析如圖4：

條件3：流動相：甲醇：水：稀磷酸=700：300：60;波長230nm。

配成700：300：60的甲醇：水：稀磷酸（0.17%）流動相，混合均勻，使用前用0.45um濾膜過濾，使用前脫氣。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品99.9mg，

于100mL容量瓶中，濃度：0.999mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動相（甲醇：水：稀磷酸=700：300：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長：230nm;進(jìn)樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間15min。

具體分析如圖5：

3 結(jié)果討論

對比上述三張圖譜觀察發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇：水=500： 500時，出峰時間很早，并且主峰不對稱，拖尾因子超過1.8，此方法不適用。當(dāng)在流動相中加入稀磷酸配制成甲醇：水：稀磷酸=300：700：60時，出峰時間太晚。然后又通過調(diào)整流動相中各成分比例，配置成甲醇：水：稀磷酸=700：300：60時，出峰時間已經(jīng)峰形都比較合適。

所以流動相的選擇對檢測樣品檢測結(jié)果起著很關(guān)鍵的作用，我們可以通過了解產(chǎn)品的性狀，進(jìn)行流動相測試試驗選擇合適的流動相，對我們的產(chǎn)品檢測有著很好的效果體現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]余振喜，庾莉菊，黃海偉，張啟明.淺談HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)時已知雜質(zhì)的計算方法[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2004.

[2]張啟明，李慧義.色譜分析中面積歸一化法測定有關(guān)物質(zhì)的弊與利[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：45-46.

[3]陳悅，陳鎮(zhèn)生.HPLC面積歸一法測定有關(guān)物質(zhì)的弊端[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2003，3（2）：29-30.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[5]郭小俠.面積歸一化法、外標(biāo)法、主成分自身對照法的異同[J].藥事縱橫，2020，4（6）：1-3.

[6] GBT16631-2008.高效液相色譜法通則[S].北京：中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2019.