霍艷兵，彭琪，彭星華，趙忠良

（邯鄲市第一醫(yī)院 血管外科，河北 邯鄲 056002）

下肢深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis,DVT）是臨床常見的血栓疾病。急性期DVT 如未得到有效治療，會因血栓機化引發(fā)下肢深靜脈血栓后綜合征（postthrombotic syndrome, PTS），嚴重影響預后[1]。臨床治療DVT 的常用方法是溶栓治療，導管直接接觸血栓（catheter-directed thrombolysis, CDT）聯(lián)合抗凝治療通過導管直接接觸血栓，增加血栓處藥物濃度[2-3]。microRNA 是一類內(nèi)源性且高度保守的非編碼單鏈RNA[4]，DVT 患者外周血和單個核細胞中microRNA-374a-5p（miR-374a-5p）存在異常表達，提示相關(guān)microRNA 可能參與DVT 的病理生理過程[5]。因此，本研究擬分析miR-374a-5p 表達水平與下肢DVT 患者臨床特征的關(guān)系及在預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年12月邯鄲市第一醫(yī)院收治的下肢DVT 患者80 例，以患者治療前miR-374a-5p 表達水平的中位數(shù)為臨界值分為高表達組和低表達組，每組40 例。同時以同期本院60 例健康體檢者的miR-374a-5p 表達水平作為參照（健康組）。所有患者采用脛前靜脈入路溶栓治療。收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、發(fā)病時間、發(fā)病部位、疾病史等信息。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

納入標準：①所有患者下肢深靜脈造影診斷為下肢DVT，且分型符合混合型診斷標準[6]：血栓累及整條肢體，包括累及髂靜脈、股總靜脈及股淺靜脈，合并累及腘靜脈或膝下靜脈；②不存在抗凝溶栓治療和介入手術(shù)治療禁忌證；③第1 次發(fā)病，就診時間均在發(fā)病2 周內(nèi)；④無嚴重心、肝、肺、腎功能不全；⑤年齡≥18 周歲；⑥簽署知情同意書。排除標準：①慢性或亞急性下肢DVT 者；②雙側(cè)下肢均存在DVT 且分型不屬于混合型者；③伴有嚴重精神疾病，惡性腫瘤，嚴重心、肝、肺、腎功能不全或伴有代謝性疾病者；⑤患有肺動脈栓塞者；⑥臨床資料不完整或未簽署知情同意書者。

1.2 儀器與試劑

Aegisy 濾器[先健科技（深圳）有限公司]，交換導絲（日本泰爾茂公司），4 F VER 導管（美國強生公司），UniFuse 溶栓導管（深圳宏澤淵博科技有限公司）?？俁NA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[賽默飛世爾（中國）公司]，PCR 試劑盒（Sigma-Aldrich 中國公司）。

1.3 治療方法

1.3.1 濾器置入所有患者取平臥位，以健側(cè)腹股溝處股總靜脈體表投影處為穿刺點，使用1%利多卡因局部麻醉后，應(yīng)用Seldinger 穿刺法順行穿刺健側(cè)股靜脈，置入4 F 鞘管造影，明確髂靜脈及下腔靜脈通暢，內(nèi)無明確漂浮血栓，管徑無異常，明確腎靜脈開口位置及無雙下腔靜脈征象。選擇大小適宜濾器，通過交換導絲置換濾器置入鞘管，將濾器輸送到預定位置，釋放固定后造影確認濾器位置及形態(tài)。在術(shù)后2 周內(nèi)將濾器取出。

1.3.2 置管在患肢踝關(guān)節(jié)上方位置扎上止血帶后穿刺足背靜脈并注射造影劑，明確脛前靜脈位置，順行造影引導下穿刺脛前靜脈成功后置入5F 血管鞘，造影明確血栓位置，應(yīng)用4F VER 導管及超滑導絲通過血栓段，更換交換導絲，于近心端置入溶栓導管，溶栓導管長度選擇30 cm，導管頭端突出血栓近心端約1 cm。

1.3.3 溶栓藥置入及監(jiān)測固定溶栓管位置后，針對患者具體情況經(jīng)溶栓管注入20 萬u ～50 萬u 尿激酶于血栓內(nèi)。術(shù)畢加壓包扎股靜脈穿刺點24h，常規(guī)包扎患側(cè)脛前區(qū)溶栓管置入部位。術(shù)后微泵每天泵入尿激酶50 萬u ～75 萬u，分2、3 次泵入，并于1 h 內(nèi)泵入完畢。溶栓治療過程中，對患者患肢行溶栓管造影1 次/2 d，并根據(jù)造影結(jié)果調(diào)整溶栓管位置。監(jiān)測患者血漿纖維蛋白原、凝血酶時間、D-二聚體及活化部分凝血活酶時間等指標，經(jīng)溶栓管造影確定血栓溶解完全后拔除溶栓管，并根據(jù)患者血栓溶解情況回收濾器，若經(jīng)1 個月治療，評估患者仍有并發(fā)肺動脈栓塞（pulmonary embolism, PE）風險則將濾器轉(zhuǎn)化為永久型?；颊叱鲈汉罄^續(xù)口服華法林0.5 ～1.0年，保持國際標準化比值（NR）為2.0 ～3.0。對患者進行定期隨訪，隨訪期為2年。

1.4 miR-374a-5p 表達量測定

混合型DVT 患者和健康組分別于入院治療前、體檢時清晨抽取空腹靜脈血5 ml，即刻3 500 r/min 離心15 min，取上清液，置入-30℃冰箱冷凍保存。采用總RNA 提取試劑盒提取外周血中總RNA，使用紫外分光光度計測定提取的總RNA 濃度，樣品A260/A280 ≥1.80 視為合格。然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，分別得到模板單鏈cDNA，然后參照PCR 試劑盒操作步驟對cDNA 進行PCR。設(shè)置的PCR 反應(yīng)條件為：95℃預變性5 min，95℃變性40 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s；連續(xù)循環(huán)40 次。采用2-△△ct法計算miR-374a-5p 的相對表達量[7]。

1.5 考察指標

1.5.1 治療前后患者患肢腫脹程度分別于治療前后測量患者髕骨上側(cè)20 cm 處及髕骨下側(cè)15 cm 處周徑，作為患側(cè)與健側(cè)下肢大小腿周徑，患肢消腫率=（術(shù)前患健側(cè)肢體周徑之差-術(shù)后患健側(cè)肢體周徑之差）/術(shù)前患健側(cè)肢體周徑之差×100%[8]。

1.5.2 患者血栓清除率及評分通過造影比較兩組患者術(shù)后血栓清除效果，分為3 級[8]。3 級：患肢癥狀或體征完全消失，血栓清除率＞95%，深靜脈血流通暢，評分為3 分；2 級：患肢癥狀或體征明顯好轉(zhuǎn)，血栓清除率為50%～95%，評分為2 分；1 級：患肢癥狀或體征無明顯好轉(zhuǎn)甚至惡化，血栓清除率＜50%，評分為1 分。

1.5.3 治療前后患者靜脈通暢度評分采用Moneta評分評估患者靜脈通暢度，涉及靜脈包括下腔靜脈、髂總靜脈、髂外靜脈、股總靜脈、股淺靜脈上下段和腘靜脈，完全通暢、部分通暢和未通暢分別記為0、1、2 分[9]。

1.5.4 患者并發(fā)癥發(fā)生情況觀察兩組患者感染、皮膚黏膜出血、穿刺點血腫、血尿血便等并發(fā)癥發(fā)生情況，比較兩組患者總并發(fā)癥發(fā)生率。

1.5.5 治療后患者PTS 發(fā)生率及嚴重程度采用Villalta 評分表征PTS，Villalta 評分內(nèi)容包括肌肉抽筋、皮膚瘙癢、疼痛、沉重感及感覺異常5 項癥狀，以及淺靜脈擴張、色素沉著、脛前水腫、皮色發(fā)紅、脂質(zhì)硬化6 項體征，根據(jù)患者癥狀和體征的嚴重程度分為無、輕度、中度、重度，評分分別為0、1、2、3 分，將5 項癥狀和6 項體征分值相加作為Villalta 評分總分，根據(jù)Villalta 評分總分判定PTS 嚴重程度，總分＜5 分表示未發(fā)生PTS，5 ～9 分表示輕度PTS，＞9 ～14 表示中度PTS，＞14 分表示重度PTS。若患肢發(fā)生過潰瘍則判定為重度PTS[10]。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用獨立t檢驗、配對t檢驗或單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗，等級資料以等級表示，比較用秩和檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組miR-374a-5p 相對表達量比較

高表達組、低表達組和健康組miR-374a-5p 相對表達量分別為（1.75±0.18）、（1.31±0.23）和（1.02±0.25），3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=109.698，P=0.000），進一步兩兩比較，高表達組高于低表達組和健康組（P＜0.05），低表達組高于健康組（P＜0.05）。

2.2 兩組患者臨床資料比較

高表達組和低表達組患者性別構(gòu)成比、發(fā)病明顯誘因、患健側(cè)大腿周徑差、患健側(cè)小腿周徑差、靜脈通暢度評分比較，差異無有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高表達組患者年齡、首發(fā)癥狀至就診時間大于或長于低表達組（P＜0.05），且高表達組患者骨科疾病手術(shù)史比例高于低表達組（P＜0.05）。見表1。

2.3 兩組患者治療前后患肢腫脹程度比較

治療后高表達組和低表達組患者患健側(cè)大、小腿周徑差較治療前均減?。≒＜0.05），但兩組患者治療后大、小腿周徑差及消腫率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組患者臨床資料比較 （n =40）

表2 兩組患者治療前后患肢腫脹程度比較 （n =40，±s）

表2 兩組患者治療前后患肢腫脹程度比較 （n =40，±s）

組別患健側(cè)大腿周徑差/cm 患健側(cè)小腿周徑差/cm 大腿消腫率/%小腿消腫率/%治療前 治療后 t 值 P 值 治療前 治療后 t 值 P 值高表達組 5.55±0.36 1.72±0.11 177.181 0.000 4.93±0.31 1.71±0.12 72.701 0.000 73.20±8.62 68.25±5.85低表達組 5.51±0.34 1.71±0.14 177.299 0.000 4.94±0.29 1.70±0.15 73.106 0.000 75.25±8.25 67.52±5.56 t 值 0.511 0.355 0.149 0.329 1.087 0.572 P 值 0.611 0.723 0.882 0.743 0.281 0.569

2.4 兩組患者靜脈通暢度評分和血栓清除率比較

治療后高表達組和低表達組患者患肢靜脈通暢度評分均較治療前低，但兩組治療后靜脈通暢度評分及血栓清除率評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 兩組患者并發(fā)癥發(fā)生情況比較

治療期間，高表達組并發(fā)癥發(fā)生率為15.0%，與低表達組的17.5%比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.092，P=0.762）。見表4。

2.6 兩組患者治療后PTS 發(fā)生率及嚴重程度比較

術(shù)后隨訪2年，高表達組和低表達組PTS 發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高表達組高于低表達組。且高表達組患者PTS 嚴重程度高于低表達組（P＜0.05）。見表5。

表3 兩組患者靜脈通暢度和血栓清除率評分比較（n =40，±s）

表3 兩組患者靜脈通暢度和血栓清除率評分比較（n =40，±s）

靜脈通暢度評分 血栓清除率評分治療前 治療后 t 值 P 值高表達組 8.94±1.32 3.38±0.61 28.395 0.000 2.68±0.15低表達組 8.92±1.28 3.39±0.64 28.539 0.000 2.66±0.12 t 值 0.069 0.072 0.658 P 值 0.945 0.943 0.512組別

表4 兩組患者并發(fā)癥發(fā)生情況比較 [n =40，例（%）]

表5 兩組患者治療后PTS 發(fā)生率及嚴重程度比較（n =40）

3 討論

抗凝治療是以往臨床上治療DVT 的標準療法，可以有效緩解血栓蔓延及肺栓塞發(fā)生、發(fā)展進程，但對預防PTS 發(fā)生及提高深靜脈通暢度效果不佳。目前國內(nèi)DVT 診治指南推薦的DVT 治療首選方案是CDT治療。目前臨床CDT 常用置管部位有健側(cè)股靜脈、大小隱靜脈、患側(cè)股靜脈等。經(jīng)健側(cè)股靜脈入路置管溶栓穿刺簡單，但其屬于逆行置管，容易損傷深靜脈瓣膜；且瓣膜對導絲通過股靜脈的阻礙較大，置管難度較高且置管成功率較低，大大提高PTS 的發(fā)生風險。而經(jīng)皮脛前、后靜脈置管屬于順行置管，不易損傷深靜脈瓣膜，且操作簡便[11]。

MicroRNA 是一種由20 ～25 個核苷酸組成的人體內(nèi)源性非編碼小分子RNA，也是生物體內(nèi)重要的一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細胞分化凋亡等多種生物學過程[4]。周蘭庭等[12]報道多種疾病如腦梗死、心肌梗死、帕金森病、腫瘤、糖尿病等患者外周血中microRNA 表達異于健康人群。外周血microRNA 有望成為疾病診斷治療以及預后判斷的新型生物學標志物。miR-374a-5p 作為microRNA 的重要亞型，在DVT 患者外周血中存在異常表達，可能是DVT 治療的一種新靶點[5]。本研究結(jié)果顯示，高表達組患者miR-374a-5p 相對表達量高于低表達組患者和健康組，高表達組患者年齡、首發(fā)癥狀至就診時間大于或長于低表達組，且高表達組患者具有骨科疾病手術(shù)史的比例高于低表達組?？赡苁怯捎诶夏昊颊呦啾扔谀贻p患者，不僅凝血功能更加亢進，血管壁老化現(xiàn)象也更加明顯，而血管壁老化會進一步改變血管內(nèi)血液流變狀態(tài)[13]。而患有骨科疾病或有相關(guān)疾病手術(shù)史患者臥床時間增加，這些因素會加劇患者血管痙攣狀態(tài)和改變血液流速，時間一久容易發(fā)生下肢靜脈回流瘀滯，從而增加PTS 發(fā)生的可能性。另外，時效性是影響DVT 的治療效果及術(shù)后復發(fā)的重要因素之一，早發(fā)現(xiàn)早治療有利于及時干預和治療，故縮短首發(fā)癥狀至就診時間顯得十分重要[14]。

本研究結(jié)果顯示，治療后兩組患者患健側(cè)大、小腿周徑差均減小、患肢靜脈通暢度評分均降低，但兩組患者大小腿周徑差減小程度、消腫率以及患肢靜脈通暢度和血栓清除率無差異；治療期間高表達組和低表達組并發(fā)癥發(fā)生率無差異。術(shù)后隨訪2年，高表達組PTS 發(fā)生率高于低表達組，且兩組患者PTS 嚴重程度有差異。說明miR-374a-5p 表達量對于患者近期療效無影響，但miR-374a-5p 表達量仍可能會影響患者遠期PTS 發(fā)生率，提示miR-374a-5p 仍是影響DVT發(fā)生發(fā)展的重要因素。CEOLOTTO 等[15]研究結(jié)果證實miR-374a-5p 在機體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。PAN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-374a-5p 會通過與炎癥因子IL-10 mRNA 3'UTR 位點發(fā)生結(jié)合，使得IL-10 表達受到抑制，進一步引發(fā)炎癥造成血管內(nèi)皮細胞受損，從而參與DVT 的發(fā)生和發(fā)展。SEBASTIANI 等[17]研究結(jié)果顯示，miR-374a-5p 水平與DVT 嚴重程度呈正相關(guān)，miR-374a-5p 作為與DVT 嚴重程度相關(guān)的生物學指標，可以調(diào)控患者發(fā)病時的炎癥因子表達水平，從而加劇患肢炎癥反應(yīng)，導致預后不良[18]。SPIEZIA 等[19]報道溶栓、導管溶栓等治療方法可以改善DVT 患者術(shù)后近期臨床癥狀及血栓栓塞情況，但術(shù)后遠期PTS 發(fā)生情況仍主要取決于患者恢復過程中患肢血栓自身溶解、機化和再通過程，而靜脈血栓溶解再通過程由眾多因子、細胞和機制參與和調(diào)節(jié)。DERNOWSEK 等[20]報道m(xù)iR-374a-5p 等microRNA 可以通過廣泛參與和調(diào)控血管內(nèi)皮細胞遷移及成血管分化等途徑影響靜脈血栓溶解再通過程，其對比研究發(fā)現(xiàn)miR-374a-5p 可促進血管內(nèi)皮細胞歸巢，而下調(diào)miR-374a-5p 可促進血管內(nèi)皮細胞對血栓的溶解再通。

綜上所述，miR-374a-5p 在混合型DVT 患者中高表達，且高、低表達者在年齡、首發(fā)癥狀至就診時間及骨科疾病手術(shù)史中存在差異，miR-374a-5p 高表達會增加患者遠期PTS 發(fā)生率及嚴重程度。