王琳 楊曉勤 陳云

[摘 要] 為了改進(jìn)水稻葉片蛋白的雙向電泳分離方法，采用雙向電泳法分離水稻葉片蛋白，比較和分析了兩種上樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。改進(jìn)的上樣量靈敏度高，分離條帶多且清晰，表明改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法可以得到更為靈敏、清晰的圖譜，能更好地適應(yīng)和促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)驗(yàn)教學(xué);改進(jìn);雙向電泳;葉片

[中圖分類號(hào)] Q503? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? [文章編號(hào)] 1674-9324（2020）41-0383-02? ? [收稿日期] 2020-04-02

目前，雙向電泳技術(shù)是研究蛋白組學(xué)十分重要的技術(shù)手段，特別是以固相pH梯度等電聚焦為第一向的雙向電泳技術(shù)是當(dāng)前分辨率最高，信息量最大的電泳技術(shù)。它具有結(jié)果直觀，分辨率較高，信息量大，技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，因此，此實(shí)驗(yàn)也成為本科生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要內(nèi)容。

在雙向電泳中，上樣量大小取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目、檢測(cè)方法的靈敏度及膠條的pH梯度范圍和長(zhǎng)度。不同樣品中蛋白的種類、數(shù)目有一定差異，所以在檢測(cè)方法相同，一向IPG膠條pH梯度范圍和長(zhǎng)度相同的條件下，不同樣品的蛋白上樣量有差異。為了獲得一個(gè)分辨效果好和重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，得到質(zhì)量高的水稻葉片蛋白電泳分離效果，找出合適的蛋白上樣量很重要。作者在使用雙向雙向分離水稻葉片蛋白實(shí)驗(yàn)的傳統(tǒng)方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)原來(lái)的蛋白上樣量分離的蛋白斑點(diǎn)較少且模糊。為了提高水稻葉片蛋白的電泳分離效果，本文對(duì)此進(jìn)行了探討。

一、方法

（一）常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法

首先采用三氯乙酸-丙酮法提取水稻葉片蛋白。將葉片研磨至葉片成粉末狀，加入溶液A（10%三氯乙酸（TCA）和0.07%β-巰基乙醇的預(yù)冷丙酮溶07%β-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液）懸浮沉淀。4℃，11000rpm離心15min，棄上清，重復(fù)兩次，將最終得到的沉淀真空冷凍干燥，然后用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最后通過(guò)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分離水稻葉片蛋白。稱取一定量的水稻葉片凍干樣品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer 4-7，1%DTT），樣品超聲波處理五次，每次3-5s，間隔3s，于冰水中裂解30min，14000rpm離心20min，取上清，再離心，取上清，以充分去除雜質(zhì)，獲得的蛋白樣品除少量用作濃度測(cè)定外，其余進(jìn)行分裝，于-80℃保存。每次用之前，將分裝的蛋白樣品取出，室溫下解凍，根據(jù)所需總的蛋白質(zhì)質(zhì)量取一定體積的蛋白樣品，分別加入相應(yīng)水化液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，0.4%DTT，0.5%IPG buffer pH4-7或pH3-10），終體積為350μL，再加入微量溴酚藍(lán)振蕩混勻，2000rpm離心1min，將含樣品的水化液均勻地加到水化盤(pán)中。第一向等電聚焦時(shí)，取pH4-7L，18cm干膠條，去掉保護(hù)膜，準(zhǔn)備水化。把干膠條膠面朝下置于水化盤(pán)中水化，加入IPG覆蓋液使整個(gè)IPG strip被覆蓋。水化時(shí)間為10-12小時(shí)，溫度20℃。取出水化好的膠條，膠面朝上置于持膠槽中，膠條正負(fù)極與持膠槽正負(fù)極要一致，并使膠條與持膠槽兩端電極充分接觸，加適量IPG覆蓋液覆蓋整個(gè)IPG strip。水化前把樣品液加入水化液中。再根據(jù)合適的電泳參數(shù)進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后，取出膠條，加入平衡液A（6mol/L尿素，0.05mol/LTris-HCI，2%SDS，30%甘油，0.1%DTT，0.002%溴酚藍(lán)）振蕩平衡15 min，再換平衡液B（6 mol/L尿素，0.5mol/L Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.4%碘乙酰胺，0.002%溴酚藍(lán)）振蕩平衡15 min，取出膠條輕輕潤(rùn)洗，并去除多余的平衡液，準(zhǔn)備第二向電泳。采用分離膠濃度為12.5%的連續(xù)SDS-PAGE垂直平板電泳。將已平衡好的第一向膠條置于第二向凝膠的上方，排除氣泡，使二者緊密接觸。用1%瓊脂糖凝膠封固膠條，接通電源，以15℃循環(huán)水浴冷卻。15mA/塊膠恒流電泳30min，待溴酚藍(lán)前沿移至分離膠中后，再增大電流至30mA/塊膠，待溴酚藍(lán)前沿距凝膠板底0.5-1cm處，終止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于固定液（40%無(wú)水乙醇，10%冰乙酸）中固定30min或過(guò)夜，倒去固定液，以雙蒸水洗4次，每次15min，然后在染色液（0.12% CBB G-250，10% ammonium sulfate，10% phosphoric acid and 20% methanol）中染色3～4小時(shí)，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色30min，然后用蒸餾水漂洗數(shù)次直至背景顏色淺淡，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰即可，掃描儀掃描膠圖。具體方法參照王[5]等。

（二）實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法中的蛋白質(zhì)樣品上樣量為100ug。改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法中蛋白質(zhì)樣品上樣量為150ug。

二、結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)比較了100μg和150μg兩個(gè)上樣量的雙向電泳分離水稻葉片蛋白效果，圖1（a）上樣量為100μg，圖1（b）上樣量為150μg，雖然圖1（a）的背景較淺，但蛋白斑點(diǎn)明顯少于圖1（b），很多低豐度蛋白在圖1（a）中無(wú)法檢測(cè)到，而圖1（b）中蛋白斑點(diǎn)相對(duì)較多，圖1（a）中清晰的蛋白斑點(diǎn)在圖1（b）中進(jìn)一步加深，有些圖1（a）中檢測(cè)不到的點(diǎn)在圖1（b）中檢測(cè)到了。因此150μg的上樣量比100μg的上樣量更適合水稻葉片蛋白的雙向電泳分離。

三、討論

上樣量大小對(duì)雙向電泳總的蛋白質(zhì)的覆蓋率有很大的影響?？刂坪蒙蠘恿?，可以得到令人滿意的雙向電泳圖譜，提高重復(fù)性，并有利于后續(xù)的進(jìn)一步分析。上樣量太小會(huì)造成蛋白點(diǎn)稀少，上樣量太大會(huì)造成一向等電聚焦時(shí)電流太大，使得第一向電泳無(wú)法達(dá)到最佳分離效果;第二向電泳中出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾等現(xiàn)象，對(duì)結(jié)果分析有很大影響。改進(jìn)的上樣量更有利于獲得蛋白數(shù)量多、背景清楚、靈敏度高的凝膠圖像，更適合雙向電泳分離水稻葉片蛋白的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)方法克服了雙向電泳分離水稻葉片蛋白傳統(tǒng)方法的一些不足，如用100ug的上樣量改進(jìn)為150ug的上樣量，得到了更為靈敏、清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更好地適應(yīng)和促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作，也有利于其他老師從中得到啟發(fā)。

參考文獻(xiàn)

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